CXCL5基因敲除小鼠抑郁样行为及血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平变化

袁东亮，权伟，陈奕晨，龚阳泽，刘凌之，邵青，翟媛媛，赵正杭

1 西安交通大学基础医学院，西安 710061；2 空军军医大学唐都医院药剂科；3 西安市精神卫生中心药剂科

传统观念认为，由于血脑屏障的存在，中枢神经系统通常被视为“免疫豁免区”；但近年研究显示，在中枢神经系统内也可出现炎症介质水平增高［1］。神经炎症假说在抑郁症病理机制中具有重要作用［2］。有研究表明，通过基因芯片筛选抑郁症小鼠海马组织中差异表达的炎症因子基因，发现CXC 趋化因子配体5（CXCL5）表达差异最为明显。趋化因子是一类小分子碱性蛋白，主要功能是趋化细胞定向移动。CXCL5 为趋化因子CXC 家族成员，主要表达于中性粒细胞、单核细胞，也可表达于嗜酸性粒细胞。中性粒细胞是先天性免疫监视的重要组成部分，同时在炎症导致的病理损伤中发挥重要作用［3］。研究显示，CXCL5 信号通路与神经炎症及血脑屏障损伤相关，并可导致脑白质损伤［4］。另有学者发现，CXCL5 与创伤性脑损伤、人脑内皮屏障破坏等相关［5］。CXCL5与抑郁症的关系及其相关机制需要进一步验证。2021 年6 月—2022 年1 月，我们通过繁殖CXCL5 基因敲除小鼠，并进一步构建抑郁症模型，观察其行为学及血清炎症因子水平，初步探讨CXCL5在抑郁症发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

1.1.1 实验动物 新生CXCL5＋/－杂合子小鼠4只，5～6 周龄，雌雄各半，体质量（18±2）g，购自广州赛业生物科技有限公司。小鼠饲养于空军军医大学实验动物中心SPF级动物房，室内温度20～25 ℃，湿度50%～60%。每周换2 次垫料，隔天添加食物和水。新生C57野生型小鼠16只，4周龄，雌雄各半，体质量（18±2）g，购自空军军医大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂与仪器 TreliefTMMouse Direct PCR Kit（Genotyping）试剂购自北京擎科生物科技有限公司；DL1000 bp DNA Maker 购自宝生物（大连）有限公司；琼脂糖粉购自德国Sigma 公司；引物由北京擎科生物科技有限公司合成。Mini-Sub cell G 电泳仪及凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司；PCR仪器购自Applied Biosystems 公司；低温高速离心机购自德国Hettich 公司。TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.2 CXCL5＋/－杂合子小鼠的繁殖 取饲养12周达到性成熟的CXCL5＋/－杂合子小鼠，雌雄配对分为两笼进行繁殖。取繁殖后的子代小鼠行基因型鉴定。

1.3 子代小鼠基因型的鉴定 取出生4 周的子代小鼠，剪取小块鼠尾，采用qRT-PCR 法进行基因型鉴定。提取组织DNA，使用NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA 的质量浓度和纯度。按照TreliefTMMouse Direct PCR Kit（for Genotyping）试 剂盒操作说明进行扩增，引物序列：CXCL5 敲除型上游 5＇-AAGACGACGGACGTGGGGTT-3＇，下 游 5＇-GGAGGGAAAGCCTATTTGGC-3＇，条带长度856 bp；CXCL5 野 生 型 上 游5＇-CATGTTTGAATATGGATTGCTGAG-3＇，下游5＇-GGAGGGAAAGCCTATTTGGC-3＇，条带长度711 bp。扩增体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，无酶水9.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 模板1 μL。扩增条件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 个循环；72 ℃7 min。取扩增产物5 μL，加入1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压60～100 V，电泳30 min 后取出，凝胶成像仪观察结果。纯合子（CXCL5＋/＋）基因型的扩增产物为711 bp，纯合子（CXCL5－/－）基因型的扩增产物为856 bp，均在凝胶成像显示为一个条带。杂合子（CXCL5＋/－）基因型的产物为711 bp 及856 bp，在凝胶成像显示为两个条带。

1.4 CXCL5－/－小鼠的筛选 雌雄双杂合子交配，其子代可能出现纯合子CXCL5＋/＋、杂合子CXCL5＋/－和纯合子CXCL5－/－3 种基因型。鉴定为CXCL5－/－的子代小鼠用于继续繁殖，CXCL5＋/＋及CXCL5＋/－小鼠不是实验所需，全部处死。因抑郁症小鼠在造模过程中可能发生死亡，为了保证足够数量进行体质量监测和行为学评估、血清检测，故待CXCL5－/－小鼠繁殖至30 只再开始后续实验。最终获得16只雌性、14只雄性CXCL5－/－小鼠。

1.5 小鼠体质量检测 取CXCL5－/－小鼠和C57 野生型小鼠各8只，雌雄各半，记录小鼠4、6、8、10周龄时的体质量。

1.6 小鼠抑郁症模型的建立 由于雌鼠性激素水平波动明显，抑郁模型不稳定，故只取雄鼠建立抑郁症模型。取10 周龄雄性CXCL5－/－小鼠和雄性C57野生型小鼠，以慢性不可预见性的温和刺激（CUMS）配合孤养建立抑郁症模型［6］。小鼠单独饲养，1 只/笼。CUMS 刺激因素：①45℃热刺激5 min；②夹尾5 min；③6 ℃冷水游泳5 min；④摇晃5 min；⑤夜间强光照射5 min；⑥禁食24 h；⑦禁水24 h。在28 d 内每天随机给予上述1 种刺激，使小鼠不能预料刺激的发生，以避免产生适应，每种刺激实施4次。以小鼠出现自主活动明显减少为造模成功。

1.7 小鼠抑郁症的行为学评估 取小鼠进行抑郁症行为学评估。①强迫游泳实验（FST）：将小鼠放进盛水的透明玻璃杯中，水温（22 ± 1）℃，水深12 cm。实验持续6 min，使用高清数码摄像机记录小鼠的活动，采用双盲法统计后4 min内小鼠在水中一动不动的时间。②悬尾实验（TST）：将小鼠尾巴用胶带固定悬挂起来，固定位置在距离尾尖约1 cm处，小鼠头距离放置固定平台的桌面约10 cm。实验持续6 min，使用高清数码摄像机记录小鼠的活动，采用双盲法统计小鼠在6 min内不动的总时间。1.8 小鼠血清炎症因子检测 行为学评估结束后，小鼠腹主动脉取血，室温静置30 min，4 ℃下4500 r/min 离心5 min，分离血清。按照ELISA 试剂盒说明书方法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.9 统计学方法 采用GraphPad Prism 统计软件。符合正态分布的计量资料以-x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCL5－/－小鼠与野生型小鼠的体质量比较雄性及雌性CXCL5－/－纯合子小鼠在4、6、8、10 周龄时的体质量与同周龄、同性别野生型小鼠比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 CXCL5－/－小鼠与野生型小鼠4、6、8、10周龄的体质量比较（g，±s）

表1 CXCL5－/－小鼠与野生型小鼠4、6、8、10周龄的体质量比较（g，±s）

组别CXCL5－/－小鼠雌性雄性野生型小鼠雌性雄性n 8 4 4 8 4 4体质量第4周10.12±0.6512.08±0.9711.22±0.7312.56±1.24第6周17.78±0.8719.25±0.6618.21±0.6520.23±1.46第8周19.73±0.4522.45±1.5420.21±0.9823.72±1.13第10周20.72±1.5323.68±1.6021.13±1.5224.43±1.41

2.2 CXCL5－/－与野生型抑郁症小鼠行为学比较CXCL5－/－抑郁症小鼠的TST、FST 实验不动时间均较野生型抑郁症小鼠缩短（P均＜0.05）。见表2。

表2 CXCL5－/－与野生型抑郁症小鼠抑郁症行为学比较（min，±s）

表2 CXCL5－/－与野生型抑郁症小鼠抑郁症行为学比较（min，±s）

注：与野生型比较，*P＜0.05。

组别CXCL5－/－小鼠野生型小鼠n 8 8 TST实验不动时间1.64±0.36*2.14±0.41 FST实验不动时间0.71±0.21*1.50±0.23

2.3 CXCL5－/－与野生型抑郁症小鼠血清炎症因子水平比较 CXCL5－/－抑郁症小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均较野生型抑郁症小鼠降低（P均＜0.05）。见表3。

表3 CXCL5－/－与野生型抑郁症小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较（pg/mL，±s）

表3 CXCL5－/－与野生型抑郁症小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较（pg/mL，±s）

注：与野生型比较，*P＜0.05。

组别CXCL5－/－小鼠野生型小鼠n 8 8 TNF-α 427.4±124.1*566.4±127.5 IL-1β 85.8± 9.1*121.9±20.4 IL-6116.9±11.4*149.4±17.0

3 讨论

抑郁症是一种常见且容易复发的精神疾病，其病因复杂，主要由遗传、代谢和社会因素等多方面因素影响，具体的发病机制尚不明确。其中免疫介导的抑郁症机制深受研究者的关注，以往对精神疾病的免疫机制研究主要集中在促炎细胞因子方面，大量临床实验研究显示抑郁症与中枢和外周血中促炎症因子的增加有关，外周血中炎症因子可通过特异性转运蛋白跨过血脑屏障的方式在脑中扩散，激活或参与脑部炎症反应，最终影响脑部情绪调节区域的神经元活动和神经递质的释放，进而引发抑郁症状［7］。先前的研究忽略了其他免疫蛋白，如趋化因子。目前研究表明，趋化因子在多种精神疾病如抑郁症［8］的发生过程中起重要作用，这一作用已超出其经典趋化作用，主要包括神经调节作用，神经递质样作用，直接或间接神经生成调节作用［9］。相关的趋化因子包括CXC 趋化因子配体8、CC 趋化因子配体（CCL）2、CCL3、CCL5。这些蛋白可能成为未来诊断及治疗抑郁症新的标志物或治疗新靶点。

我们的前期研究采用炎症细胞因子与受体PCR芯片，检测了84个炎症细胞因子基因在应激性抑郁症小鼠脑区差异表达情况，筛选出趋化因子CXCL5［3］；认为该基因可能成为未来诊断及治疗抑郁症新的标志物或治疗靶点。但是CXCL5参与抑郁症发生的机制仍不十分清楚。因此，CXCL5基因敲除小鼠可为进一步研究该基因与抑郁症的相关性奠定基础。

我们使用4只CXCL5＋/－杂合子小鼠进行繁殖获得CXCL5－/－纯合子小鼠，并采用PCR法鉴定了子代的基因型。经鉴定为的纯合子的雌雄小鼠，进一步繁殖备用，并对基因敲除型及野生型小鼠的体质量进行监测。这是因为该基因敲除小鼠为完全基因敲除技术，通过体质量监测初步来评估基因敲除对小鼠的健康生长是否有较大影响。通过研究发现两组体质量无显著差异，证明该基因的敲除对小鼠的健康影响不大，可进行下一步抑郁样行为学实验研究。

CUMS 模拟了部分应激原，外部环境刺激，经过4 周的应激刺激会使动物机体的功能障碍，导致抑郁症的发生。CUMS 造模后动物出现体运动能力降低，快感缺乏及血浆皮质激素升高等均与人类抑郁症状相似，能较真实地模拟抑郁症病人的某些病因和症状，因此是比较理想可靠的抑郁动物模型［10］。FST 实验是评价抑郁样行为的经典实验方法，通过直接观察小鼠强迫游泳6 min内后4 min的不动时间来判断抗抑郁反应。不动时间越长，抑郁作用越强。TST 实验是一种经典而又能快速评价抑郁的方法。其原理是利用小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱，从而放弃挣扎，进入特有的抑郁不动状态，实验过程中记录动物不动时间来反映抑郁状态。本研究结果显示，CXCL5－/－小鼠和野生型小鼠在应激性抑郁状态下的行为学特征，发现CXCL5－/－小鼠的强迫游泳不动时间及悬尾不动时间均显著缩短，证明该基因可能与小鼠抑郁样行为有关；提示CXCL5 的敲除阻断了应激引起的小鼠抑郁样行为。

IL-1β是IL-1家族中的重要成员，由于其在炎症相关疾病中的重要作用而备受关注。IL-1β 具有较强的促炎活性，可诱导多种促炎介质，如细胞因子和趋化因子［11］。与IL-1β相似，TNF-α是一种多效性促炎细胞因子，属于TNF 配体超家族。TNF-α 在调节多种发育和免疫过程中发挥不同的作用，包括炎症、分化、脂质代谢和凋亡等，与多种疾病的发生发展有关［12-13］。IL-1β 的局部激活是介导促炎反应的中心环节，导致继发性炎症介质（包括IL-6）的激活［14］。有研究显示，TNF-α、IL-1β、IL-6 等在脑梗死后抑郁症患者的血清中升高，而抗抑郁药物能降低以上炎性因子［15-16］。本研究结果显示，野生型抑郁症小鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等均升高，而CXCL5－/－抑郁症小鼠血清炎症因子水平降低，说明敲除CXCL5 能够减轻抑郁小鼠血清炎症因子水平，提示敲除CXCL5 可能在一定程度上减轻抑郁造成的炎症级联反应。综上所述，本研究采用CXCL5＋/－杂合子小鼠成功繁殖获得CXCL5－/－纯合子小鼠；CXCL5的敲除阻断了应激引起的小鼠抑郁样行为，并在一定程度上减轻了抑郁造成的炎症级联反应。这将为CXCL5与抑郁症发病机制的深入研究奠定基础。