护骨胶囊灌服对大鼠激素性股骨头坏死的改善作用及机制

杨国柱，阮世纳，潘翠萍，钟佳贤，曹祺，李青南

1 广东药科大学生命科学与生物制药学院，广州 510006；2 广东安诺药业股份有限公司

股骨头坏死是由于不同的病因破坏股骨头的血液循环，造成骨细胞、骨髓造血细胞和脂肪细胞坏死的病理过程，最终导致股骨头塌陷的一种疾病。长期使用糖皮质激素会造成股骨头供血供氧不足，软骨下骨明显变形，股骨头塌陷和骨细胞坏死等，形成激素性股骨头坏死（ONFH）。ONFH 占非创伤性股骨头坏死发病率的50%以上［1］。ONFH 的主要病理表现为骨量减少、软骨破坏、全身机能减退、功能障碍等，致残率极高。对于ONFH 的治疗，目前西医尚无特效药物，中医药治疗有其独特优势。ONFH 的中医常见证型有肝肾亏虚证、痰瘀阻络证、气滞血瘀证等，应用活血化瘀、补肾健骨、消肿止痛、扶正固本的中药，能够有效治疗ONFH［2］。护骨胶囊是从制何首乌、淫羊藿、熟地黄、龟甲、巴戟天、杜仲、续断、骨碎补、当归、山药中提取有效成分，加工而成的中药复方制剂，具有补肝肾、益精血、调理阴阳的功效。动物实验表明，护骨胶囊能够促进成骨，改善骨代谢［3-4］。临床研究表明，护骨胶囊可以有效防治原发性骨质疏松和激素性骨质疏松症［5-6］，但在股骨头坏死的应用上尚属空白。研究显示，骨质疏松与股骨头坏死不仅具有相同的阳虚血瘀的病机，而且还具有某些相同的关键靶点和信号通路［7］。因此推测，护骨胶囊对ONFH 可能具有一定的治疗作用。2019年1 月—2021 年6 月，我们采用脂多糖和甲强龙联合注射诱导制作ONFH 大鼠模型，观察护骨胶囊对坏死股骨头坏死的改善作用，为开发护骨胶囊的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠56 只，雌雄不限，8 周龄，体质量（200 ± 20）g，购于广东省医学实验动物中心，饲养于广东药科大学动物实验中心。饲养环境：昼夜12 h/12 h 循环照明，环境温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%。大鼠自由饮水，饲喂普通维持饲料，适应性饲养1 周用于实验。本实验通过广东药科大学动物实验伦理委员会审核批准。

1.1.2 药物及试剂 护骨胶囊（广东安诺药业股份有限公司），甲泼尼龙琥珀酸钠（简称甲强龙，美国辉瑞），脂多糖（上海碧云天），注射用青霉素钠（哈药集团）。水合氯醛（国药集团），二甲苯、无水乙醇、氯化钠、甲酸、甲醛（天津大茂），甲苯胺蓝染液（北京雷根）。

1.1.3 主要仪器 石蜡包埋机（德国莱卡，型号EG1160）；组织切片机（德国莱卡，型号RM2255）；Bioquant-Osteo 骨形态学图像分析系统（美国BIOQUANT）。

1.2 动物分组与模型制作 将56 只大鼠采用随机数字表法分为空白对照组4只和模型组52只。模型组于造模第1 周先腹腔注射脂多糖（LPS）20 μg/kg，连续2次，给药相隔24 h；完成LPS注射24 h后，经臀肌注射大剂量甲强龙40 mg/kg，连续3 次，给药间隔24 h。造模第2～6 周，甲强龙用量减至维持剂量20 mg/kg，每周1次，连续5周。每次注射甲强龙后，臀肌注射青霉素钠8 万U。药物干预过程中悬吊饮水，即将水瓶悬吊在鼠笼上方，使大鼠饮水时尽可能提起双前肢，以模拟人的双下肢负重。空白对照组在此过程中腹腔注射等量生理盐水。6 周后，从模型组中随机抽取4 只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取股骨头组织脱钙处理，光镜下观察股骨头形态，以出现骨坏死、骨小梁断裂和骨髓细胞脂肪化为造模成功。

1.3 干预处理 造模成功后，将模型组剩余48 只大鼠按随机数字表法分成3 组，模型对照组、护骨胶囊基础剂量组和护骨胶囊双倍剂量组。以体质量60 kg 的成年人每日服用护骨胶囊的剂量进行等效换算，护骨胶囊基础剂量组给予护骨胶囊0.486 g/（kg·d）灌胃，双倍剂量组给予护骨胶囊0.972 g/（kg·d）灌 胃；模 型 对 照 组 给 予10 mL/（kg·d）生理盐水灌胃，每天1 次。大鼠均自由进食和饮水。

1.4 一般状况观察 观察各组大鼠的皮毛、饮食、活动情况。称取大鼠体质量，造模期间每周1次、药物干预期间每天1次，计算大鼠体质量增长率。

1.5 血清骨代谢指标检测 空白对照组于药物干预前全部处死，其他三组分别于给药42 d 和给药60 d 后各取8 只大鼠，空腹12 h 后给予10%水合氯醛10 mL/kg 进行腹腔麻醉。心脏取血5 mL，3000 r/min 离心，取上层血清，使用大鼠血清酶联免疫检测试剂盒检测骨形成标志物骨特异性碱性磷酸酶（BALP）、Ⅰ型前胶原氨基末端肽（PINP）和骨吸收标志物抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP5b）、Ⅰ型胶原交联C-末端肽（CTX）水平。

1.6 股骨形态学观察 大鼠取血后，取出右侧股骨头，暴露部分骨髓腔，加入4%甲醛溶液固定24 h，10%乙二胺四乙酸脱钙2 个月。梯度乙醇脱水，矢状面切开，石蜡包埋、切片，甲苯胺蓝染色。应用Bioquant-Osteo 骨形态学图像分析系统软件，观察股骨头关节软骨、软骨下骨区和生长板软骨的形态学表现。

1.7 统计学方法 采用SPSS11.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以-x±s表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状况比较 造模期间，空白对照组反应灵敏，多动，进食佳，皮毛光泽，体质量增长规律；模型组反应略有迟钝，活动倦怠，进食正常，皮毛较松。药物干预期间，模型对照组神态、活动无明显好转；护骨胶囊基础剂量和双倍剂量组进食、活动均有所好转，肢体活动明显增多。各组大鼠造模期间、药物干预期间的体质量增长率比较，差异均无统计学意义，见图1、2。

图1 造模期间各组大鼠体质量增长率

图2 药物干预期间各组大鼠体质量增长率

2.2 血清骨代谢指标比较 与空白对照组相比，模型对照组血清BALP、TRAP5b、PINP、CTX 水平在干预42 d 和60 d 均升高（P均＜0.01）。与模型对照组相比，护骨胶囊基础剂量组和双倍剂量组干预42 d 和60 d 后，血清BALP、TRAP5b、PINP、CTX 水平均降低（P均＜0.01），其中双倍剂量组上述指标均较基础剂量组降低（P均＜0.01）；在相同剂量组内，干预42 d 与60 d 相比差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 各组血清BALP、PINP、TRAP5b、CTX水平比较（±s）

表1 各组血清BALP、PINP、TRAP5b、CTX水平比较（±s）

注：与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与同时点模型对照组比较，*P＜0.01；与同时间点护骨胶囊基础剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别模型对照组42 d 60 d护骨胶囊基础剂量组42 d 60 d护骨胶囊双倍剂量组42 d 60 d空白对照组n 8 8 8 8 8 8 4 BALP（IU/L）1774.22± 40.51##1843.06± 76.46##1312.68±101.42*1333.96± 56.60*1167.28± 65.40##*△△1129.07± 51.90*△△1392.11±114.61 PINP（μg/L）25.48±1.62##23.11±2.87#18.04±1.13*18.81±1.07*16.61±1.55*△16.28±1.09##*△△18.68±1.49 TRAP5b（U/L）1016.69±32.31##1030.66±62.76##766.75±34.05*769.64±39.12*632.16±42.77*△△651.25±38.70*△△739.56±85.33 CTX（μg/L）76.20±1.49##78.85±4.72##56.99±3.53*57.13±4.71*49.15±2.47##*△△50.61±3.09##*△△55.79±1.38

2.3 各组股骨头形态学比较

2.3.1 股骨头关节软骨区域 空白对照组关节软骨软骨面光滑，结构连续完整；移行层结构明显，幼稚软骨细胞多呈扁平形，长轴多与关节面平行；辐射层着色较深，软骨细胞呈圆形，位于软骨陷窝内，呈同源细胞群排列；潮线界限明显，可见潮线下方的钙化层和软骨细胞。模型对照组干预42 d时关节软骨面欠光滑，移行层偏少，与辐射层界限不清，辐射层软骨细胞呈同源细胞群排列，但软骨陷窝多为空骨陷窝，潮线不清晰；干预60 d 时关节软骨面欠光滑，移行层少，辐射层同源细胞群较少，少见空骨陷窝，潮线不清晰。护骨胶囊基础剂量组给药42 d时关节软骨面欠光滑，软骨多层结构不清晰，软骨细胞明显增多，柱状排列，以幼稚细胞为主，同源细胞群少见；给药60 d 时软骨细胞较42 d 时细胞体积变大，软骨细胞多为圆形，同源细胞群多见。护骨胶囊双倍剂量组给药42 d 时关节软骨面光滑，软骨多层结构较清晰，同源细胞群数目较基础剂量组增多，偶见空骨软骨陷窝；给药60 d 时可见清晰深染的关节软骨表面，纤维束结构连续完整，移行层和辐射层结构界限清晰可见，细胞各层软骨细胞形态明显清晰，少见空骨软骨陷窝。

2.3.2 股骨头骺板区域 空白对照组骺板静止区、增殖区和肥大区清晰可见；静止区与上方的软骨下骨板相邻，结构连续，而增殖区和肥大区软骨细胞排列成明显的柱状，下方与海绵体和骨小梁相邻。模型对照组干预42 d 和60 d 均见骺板内结构紊乱，软骨细胞柱结构不连续，静止区与上方的软骨下骨板，以及下方的增殖区与肥大区之间有出现了水平结构断裂，增殖样软骨细胞数量减少或缺如。护骨胶囊基础剂量组干预42 d时骺板结构明显较模型对照组清晰，软骨细胞柱清晰可见，但骺板上与软骨下骨板相邻处仍可见部分断裂；干预60 d时，骺板结构清晰正常，与软骨下骨板相连的静止区软骨细胞层数较42 d时增多，增殖区软骨柱结构紧密，骺板上下结构连续性好，少见断裂。护骨胶囊双倍剂量组干预42 d 时可见骺板上方与骨板有部分断裂，而60 d 可见清晰的骺板结构，且骺板上、下方结构连续性好，几无断裂。2.3.3 股骨头软骨下骨区域 空白对照组股骨头软骨下血管丰富，骨小梁粗大，编织状排列，骨髓窦内充满骨髓细胞，仅见少量脂肪细胞。模型对照组可见明显骨坏死，骨小梁排列紊乱，稀疏断裂，夹杂大量未完全吸收的骨小梁坏死碎片，骨髓窦内细胞减少甚至缺如，脂肪细胞肥大融合成空泡，部分表现为囊性样变。软骨下血管内可见淤血。护骨胶囊基础剂量组干预42 d 时骨坏死状况有所改善，骨小梁断裂减少，未吸收的骨小梁碎片也明显减少，但排列仍然紊乱；干预60 d 时坏死骨组织进一步减少。护骨胶囊双倍剂量组干预42 d 时骨小梁紊乱有所改善，近钙化软骨下方可见有部分淤血。部分骺板处仍有断裂。护骨胶囊双倍剂量组干预60 d时软骨下骨区内骨小梁粗大，结构明显清晰，软骨下骨区与骺板结构连续，无断裂。

3 讨论

ONFH 显著影响患者的生活质量，严重者需进行人工关节置换术。与西药和手术等治疗手段相比，中药复方治疗ONFH 具有无创方便、价格低廉的优势，更容易被患者所接受。目前，中药复方股骨头坏死愈胶囊治疗早期非创伤性股骨头坏死［8］、活血生骨汤治疗中老年激素性股骨头坏死［9］经临床验证，已取得较为满意的效果。中药护骨胶囊是由制何首乌、淫羊藿、熟地黄、龟甲、巴戟天、杜仲、续断、骨碎补、当归、山药中提取有效成分，经一定工艺加工而成的中药复方胶囊制剂。其具有补肝肾、益精血、调理阴阳的功效，临床研究显示，护骨胶囊用于防治原发性骨质疏松和继发性骨质疏松具有较好的疗效。基于骨质疏松和股骨头坏死某些病机和治疗方案的相似性，本研究探讨了护骨胶囊对股骨头坏死的治疗作用。

本研究应用小剂量脂多糖联合甲强龙制备大鼠ONFH 模型［10］。小剂量脂多糖能产生施瓦茨曼反应，使机体血管处于髙凝状态甚至出现弥漫性血管内凝血。当大鼠机体处于高凝状态，短时间大剂量的甲强龙冲击可造成激素性股骨头缺血坏死。大剂量短期甲强龙冲击后，换成小剂量甲强龙注射，能够有效减少动物死亡，同时保证高的成模率。本研究结果显示，模型组一般状况较差；镜下观察股骨头形态，出现股骨头关节软骨变薄，同源软骨细胞缺少，软骨下骨区大片骨坏死，骨小梁断裂，空骨陷窝增加，骨髓窦内细胞减少甚至缺如，出现大量脂肪细胞空泡。以上表现符合股骨头坏死的特征，说明ONFH模型制作成功，为后续实验提供了良好的模型。

骨代谢指标是指骨组织在代谢过程中产生的相关产物和激素，这些指标可以从血液或尿液中检测到，能够反映骨代谢水平。骨代谢指标主要包括钙磷代谢调节指标、骨形成标志物、骨吸收标志物等。本研究选择BALP、PINP 这两种骨形成标志物，和TRACP5b、CTX 这两种骨吸收标志物进行研究。结果显示，与空白对照组相比，模型对照组干预42 d和60 d 时血清BALP、PINP 水平升高，表示成骨细胞的分化活动加快，呈现骨的高转换；护骨胶囊不同剂量组血清BALP、PINP 水平均下降，代表成骨细胞的分化活动下降且骨转换减缓；与模型对照组相比，护骨胶囊促进骨形成，骨转换减缓，双倍剂量组骨形成指标下降尤为明显。而反映骨吸收的指标中，与空白对照组相比，模型对照组血清CTX、TRACP5b 在42 d 和60 d 显著升高，提示模型对照组体内破骨细胞很活跃，骨吸收加快，Ⅰ型胶原降解产物增多；与模型对照组相比，护骨胶囊给药后CTX、TRACP5b均明显回落，提示护骨胶囊能够抑制大鼠破骨细胞的活性，抑制骨吸收，Ⅰ型胶原降解产物减少；与护骨胶囊基础剂量组相比，护骨胶囊双倍剂量组的骨吸收指标下降更多。本研究还发现，在护骨胶囊相同剂量组内，42 d 与60 d 时的骨形成和骨吸收代谢指标水平无统计学差异，这与修复骨坏死是一个长期缓慢的过程，骨代谢指标变化也较为缓慢有关。综合骨形成和骨吸收的骨代谢指标变化，我们认为，护骨胶囊可以促进坏死股骨头的骨形成，抑制骨吸收，双倍剂量的护骨胶囊效果优于基础剂量。

股骨头之所以容易发生坏死，一部分原因是由于股骨头有着特殊的解剖结构和血运特点。股骨头绝大部分由关节软骨覆盖，不与周围软组织直接接触，其与位于下方的软骨下骨、骺板和骺板下小梁骨等共同承受和分配外来应力。在软骨下骨板区分布着大量的动静脉分支，这些血管不仅提供给股骨头类种类细胞的代谢需求，而且也影响着软骨下骨组织的血流灌注。股骨头内发生骨坏死时，受损断裂的骨小梁会进一步压迫骨髓窦，使骨内压异常增高，加重股骨头缺血，造成骨内恶性循环，从而在形态上表现为关节软骨、软骨下骨、骺板和血管等一系列病理表现［11-12］。临床研究也观察到病例的坏死股骨头出现了发展密切相关［13］，因此本研究也对股骨头的内部结构进行形态学的观察。本研究发现，相较空白对照组，模型对照组股骨头关节软骨变薄，软骨结构不清晰，软骨下骨区出现小的囊性样变，囊内甚至出现纤维组织增生，骨小梁杂乱断裂，出现云片状坏死，骨小梁分离度增加，以上均符合早期ONFH 的典型特征。随着护骨胶囊给药，关节软骨几层结构逐渐清晰，软骨细胞形态结构分明，同源软骨细胞群数目组明显增多，偶见空骨软骨陷窝。软骨下云片状骨坏死碎片逐渐减少，骨小梁明显变粗，骺板软骨细胞柱排列完整，结构连续。有研究［14］发现，使用甲泼尼龙制作的肉鸡股骨头坏死模型，肉鸡的股骨头生长板会出现线状裂缝，甚至断裂，认为与Ihh-PTHrP信号通路紊乱有关［15］，Ihh-PTHrP 信号通路导致软骨细胞加速成熟分化，导致生长板增殖区与肥大区软骨基质不同程度积聚，密度相差较大，软骨基质分解等原因而出现组织间隙［16］。本研究发现，模型对照组大鼠的股骨头生长板处也有明显的水平结构断裂。后续给药实验中，模型对照组使用生理盐水干预42 d 和60 d 时，骺板区域也有明显的水平结构断裂。我们认为，一方面原因是大剂量激素对软骨细胞的成熟分化造成影响，使得骺板处本应规律排列的软骨细胞柱出现异常，出现大量肥大样软骨细胞，软骨外分泌的Ⅹ型胶原、基质金属蛋白酶类等都会增多，Ⅹ型胶原的增多引起软骨基质钙化，在各向异性的牵拉作用力下，骺板在增殖带软骨细胞处出现结构断裂；另一方面原因可能是股骨头软骨下骨的骨小梁紊乱，承受股骨头应力的力学性能下降，继而小梁下方响应应力的骺板软骨进一步遭到损坏。

同时我们注意到，股骨头坏死大鼠给予护骨胶囊干预一段时间后，骨髓腔中造血细胞仍有缺失，脂肪细胞融合崩解，表现为空泡或囊样变。这可能存在两方面的原因：①骨髓造血细胞是股骨头骨组织的重要组成部分。脂多糖联合大剂量激素造模，骨髓中的造血系细胞势必会受到影响。它们的病理变化又势必影响股骨头缺血坏死的发生发展。研究显示，骨髓造血细胞的DNA 氧化损伤发生于骨细胞凋亡之前，是激素性股骨头缺血坏死的早期分子事件［17］。②本实验给药方式为治疗性给药，护骨胶囊短时间内对已损伤或发生凋亡的骨髓造血细胞影响不明显，可以考虑活血药物辅助治疗，或调整给药方式为预防性给药，或延长治疗性给药时间，再行观察骨髓窦内骨髓细胞的表现。

有研究表明，骨碎补、熟地能诱导骨髓腔中的间充质干细胞分化成软骨细胞［18］，护骨胶囊含有骨碎补和熟地，刺激间充质干细胞聚集在骺板分化成软骨细胞，使其再次进入增殖、肥大阶段，从而恢复软骨细胞柱的结构，保证软骨内成骨的功能，调节骺板上下方的成骨能力，继而增强股骨头承受机械应力的能力等。本研究结果显示，与模型对照组比较，护骨胶囊不同剂量给药组的骺板软骨细胞柱均有明显恢复，骺板上下方结构联系明显改善，这表明护骨胶囊通过促进骨髓间充质细胞的分化，使坏死股骨头的骺板结构和力学性能均有了明显的恢复。

综上所述，护骨胶囊能够抑制ONFH 模型的骨代谢的高转换状态，抑制骨吸收，调节骨代谢，改善股骨头的骨坏死和骺板损伤。相较骨质疏松症适用剂量而言，使用较大剂量的护骨胶囊干预，更有于ONFH 症的防治和改善。本研究结果为开发护骨胶囊的更多适应证提供了实验基础和理论依据。