基于网络药理学和分子对接方法探讨香叶木素治疗高尿酸血症肾病的分子机制

雷欢，邓琴，刘子源，张维，徐凌云

武汉轻工大学生命科学与技术学院，武汉 430023

高尿酸血症肾病（HN）是高尿酸血症的常见并发症，主要病因为尿酸生成过多或尿酸排泄障碍导致的肾脏急、慢性损伤。目前临床治疗HN 主要采用减少尿酸生成、促进尿酸排泄的化学药物，如别嘌醇、苯溴马隆等，但这类药物长期使用会引发严重的肝肾毒性［1］。传统中医药具有作用范围广、不良反应小的特点，在机体多种疾病中均具有显著疗效［2］。近年来，关于中医药在HN 中的作用已成为研究热点。有研究显示，菊花在治疗肾脏疾病中具有较好的疗效［3］。香叶木素是中药菊花中的一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌等药理作用［4］。我们的前期研究结果表明，香叶木素在体外竞争性抑制黄嘌呤氧化酶活性，是潜在的降尿酸药物［5］。网络药理学是基于系统生物学理论，利用计算机技术、分子生物学、药学等学科知识，对传统中药成分的潜在靶点、药理作用等进行系统研究，为研究中医药在疾病中的作用提供新方法；分子对接是通过计算机技术探索受体与药物分子之间的相互作用方式并预测其结合模式和亲和力的一种理论模拟方法。2021年9 月—12 月，本研究通过网络药理学和分子对接方法，探讨香叶木素治疗HN 的靶点及通路，为阐明香叶木素治疗HN的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 香叶木素类的成药性评价及作用靶点获取 香叶木素结构信息来自NCBI Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），通过中药系统药理学分析平台数据库（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）获得香叶木素的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）等数据，筛选标准包括口服生物利用度（OB）、药物相似性（DL）、血脑屏障（BBB）。通过TargetNet数据库（http：//targetnet. scbdd. com）中的“Lipinski 五规则”对香叶木素的成药性进行评分。通过ChEMBL（https：//www. ebi. ac. uk/chembl/）检索香叶木素作用靶点，基于SwissTargetPrediction（http：//www. swisstargetprediction. ch/）数据库预测香叶木素潜在作用靶点基因。删除重复靶点基因，通过UniProt 数据库（https：//www. uniprot. org/）将剩余靶点对应的蛋白转换成种属为智人的基因，得到香叶木素最终的作用靶点基因。

1.2 HN 疾病靶点检索 在GeneCards 数据库（https：//www. genecards. org/）、DisGeNET 数 据 库（https：//www. disgenet. org/）中，以“Hyperuricemia nephropathy”为关键词进行人类基因检索，获取HN的疾病靶点基因；去除两个数据库获取的重复靶点，从而获得最终的疾病相关靶点基因。

1.3 香叶木素与HN 共有靶点基因的筛选 将“1.1”和“1.2”中获取的香叶木素靶点基因与HN 疾病靶点基因导入Venny2.1 在线作图工具绘制韦恩图，获得香叶木素与HN的共有靶点基因。

1.4 香叶木素与HN作用核心靶点基因的筛选 将香叶木素与HN 的共有靶点基因导入STRING 数据库（https：//string-db.org/cgi/input.pl），设定物种为“homo sapiens（智人）”，构建共有靶点基因的蛋白质—蛋白质相互作用关系（PPI）网络，将结果导入Cytoscape 3.7.2 软件中，进行可视化分析。在可视化网络图中，以节点表示共有靶点基因，节点颜色越深、形状越大表示对应靶点基因的度值越大，此靶点基因越重要；以边表示共有靶点基因之间的关联，边线条越粗表示靶点基因间的结合分数越大，靶点基因与靶点基因之间的相关性越显著。以度值、介数中心性、接近中心性排名前10 位的靶点为参考指标，选取三者的共有靶点作为核心靶点。介数中心性代表经过某一节点的最短路径的数量，介数中心性越大，该节点影响力越大；接近中心性代表某一节点与网络中其他所有节点最短路径距离平均值的倒数，接近中心性越大，表示信息从一个节点传递到其他节点的速度越快。

1.5 核心靶点基因的功能分析 利用DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对香叶木素与HN 的共有靶点基因进行基因本体论（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。以P＜0.05 作为显著功能和通路的临界值，按照P值从小到大进行排序。

1.6 核心靶点的分子对接验证 从ProteinDatabase数据库（https：//www. rcsb. org/）下载核心靶点蛋白的3D结构，选择解析度小于3Å并具有配体的蛋白复合物作为蛋白受体，以保证对接的精度。将原始配体从蛋白中分离并重新对接到蛋白的活性位点，若对接后的配体小分子与原配体小分子的均方根偏差（RMSD）小于2Å，则表明对接参数设计合理，对接结果具有较高的可靠性。使用AutoDock Tools 1.5.6软件对蛋白受体进行去除水分子、分离原始配体、添加氢原子等处理，将其保存为“pdbqt”格式文件。从PubChem 数据库（https：//pubchem. ncbi. nlm. nih.gov/）下载香叶木素的2D 结构，保存为“mol2”格式，使用AutoDock Tools 1.5.6 软件进行加氢、检测分子的中心节点及可旋转键后，保存为“pdbqt”格式文件，作为配体。采用AutoDock Vina1.1.2软件将蛋白受体和香叶木素配体进行分子对接，通过结合能来评估配体和受体的结合能力，结合能小于0表示配体与受体能够自发结合，且其值越小表示两者的结合活性越高。采用PyMOL2.3 软件对结合能从小到大排名前4位的结果进行可视化展示。

2 结果

2.1 香叶木素与HN 共同靶点的筛选结果 从TCMSP 数据库获得的香叶木素ADME 结果为MW=300.28 Da，口服生物利用度（OB）=31.14%，药物相似性（DL）=0.27，香叶木素的MW＜500 Da，DL＞0.18，OB＞30%；从TargetNet 数据库获得的香叶木素Lipinski 五规则评分为100%；表明香叶木素具有很好的成药性。经筛选共获得香叶木素潜在靶点基因150 个、HN 相关靶点基因443 个，经过韦恩图分析，获得香叶木素与HN 共有靶点基因22 个。见OSID 码图1。

2.2 香叶木素与HN 作用核心靶点基因的筛选结果 香叶木素与HN 共有靶点基因的PPI 网络见OSID 码图2。该网络中共有22 个节点、85 条边，网络中未出现孤立节点，且各节点之间连通性良好，表明香叶木素通过调控多靶点协同治疗HN。拓扑学分析结果显示，该网络中度值、介数中心性、接近中心性各自排名前10位的靶点中，相同靶点分别为肿瘤蛋白p53（TP53）、雌激素受体α（ESR1）、BCL2样1（BCL2L1）、前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）、半胱氨酸蛋白酶8（CASP8）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）和ATP 结合盒转运体亚家族G成员2（ABCG2），这些靶点是香叶木素治疗HN 的核心靶点。此外，XDH 即黄嘌呤氧化酶，仅在度值中排名前10 位，但其作为尿酸生成的关键酶，也被视为香叶木素治疗HN 的核心靶点。因此，累计筛选出香叶木素治疗HN的核心靶点8个。

2.3 GO 功能注释分析结果 GO 功能注释分析共得到条目82 个，包括生物过程、细胞组成、分子功能等。其中生物过程包括51 个条目，涉及凋亡的调控、细胞增殖、蛋白的磷酸化、尿酸代谢等，P值排名前15 位的条目分别为对有毒物质的反应、对雌二醇的反应、凋亡过程的负调控、细胞增殖的正调控、肽基丝氨酸磷酸化、对药物的反应、肽基酪氨酸磷酸化、凋亡过程的调控、p53 介导的细胞周期阻滞信号转导、凋亡过程的正调控、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、有丝分裂细胞周期的G1/S期转换、细胞增殖、尿酸代谢过程、线粒体膜通透性的调节。细胞组成包括13 个条目，分别为蛋白复合物、细胞质、小窝、核质、细胞周期依赖性、蛋白激酶全酶复合物、线粒体、转录因子复合物、膜筏、内体、细胞核、胞外体、有丝分裂纺锤体。分子功能包括18 个条目，P值排名前15 位的条目分别为同蛋白结合、ATP 结合、细胞周期蛋白结合、酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白质结合、组蛋白激酶活性、转录因子结合、蛋白激酶结合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白质同源二聚化活性、RNA 聚合酶Ⅱ羧基末端结构域激酶活性、非钠依赖性有机阴离子跨膜转运蛋白活性、无机阴离子交换活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性。

2.4 KEGG通路富集分析结果 KEGG通路富集共得到35条通路，以P＜0.05为筛选条件，排名前20位的通路信息见表1。香叶木素治疗HN的主要通路包括人抑癌基因p53信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、核因子κB（NF-κB）信号通路等。

表1 香叶木素治疗HN的KEGG富集分析结果（前20位）

2.5 分子对接验证结果 各核心靶点蛋白的原始配体对接到蛋白活性位点后的RMSD 值均小于2Å，表明对接结果具有较高的可靠性。香叶木素与核心靶 点 基 因TP53、XDH、ABCG2、ESR1、MAPK1、BCL2L1、CASP8 和PTGS2 编码的蛋白的结合能分别为-8.4、-8.4、-8.1、-8.0、-7.9、-7.7、-6.9、-6.0 kcal/mol，均小于-5 kcal/mol，说明香叶木素与核心靶点蛋白间具有很好的结合活性（表2）。香叶木素与结合能排名前4 位蛋白的结合模式图见OSID码图3。

表2 核心靶点基因编码的蛋白分子对接信息

3 讨论

HN 是高尿酸血症的常见临床并发症，高水平的尿酸通过激活肾脏的氧化应激和炎症反应导致HN。肾脏是尿酸排泄的主要器官，当肾脏尿酸转运蛋白及排泄蛋白出现功能障碍时，沉积在肾脏的尿酸盐晶体进一步加重肾损伤。因此，降低肾脏的尿酸水平是治疗HN 的主要策略。香叶木素是菊花在体内的代谢产物，是黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂，具有潜在的降尿酸活性［5］。为了探讨香叶木素治疗HN 的潜力，我们基于网络药理学和分子对接方法探讨香叶木素治疗HN的分子机制。

本研究通过网络药理学共挖掘出香叶木素潜在作用靶点基因150 个、HN 疾病相关靶点基因443个，通过韦恩图获得成分—疾病共有靶点基因22个。拓扑学分析结果表明，香叶木素治疗HN 的核心靶点包括TP53、ESR1、PTGS2、BCL2L1、CASP8、MAPK1、ABCG2和XDH。

XDH 即黄嘌呤脱氢酶，又称为黄嘌呤氧化酶，是机体产生尿酸的关键酶。嘌呤类物质在XDH 的作用下产生尿酸，过量尿酸在体内形成尿酸盐结晶，沉积在肾脏的尿酸盐结晶诱导氧化与抗氧化失衡导致氧化应激性肾损伤。研究显示，尿酸盐结晶通过激活NLRP3 炎症小体及NF-κB 通路引发炎症反应，导致急、慢性肾损伤［6］。因此，抑制黄嘌呤氧化酶活性、减少尿酸生成是治疗HN的首选方法。

TP53 是一种广泛存在于组织细胞中的肿瘤抑制因子，过量尿酸导致肾脏氧化应激，活性氧的刺激导致肾细胞线粒体受损、DNA 损伤及TP53 基因表达［7］，活化的TP53 通过控制凋亡基因的表达的调节肾细胞凋亡。一方面，TP53 可以直接促进凋亡蛋白Bad、Bax、Bak 表达，降低凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-xl表达，导致HN 肾脏细胞凋亡；另一方面，TP53 通过激活Caspase 级联反应下调Bcl-2 蛋白家族，诱导肾脏细胞凋亡［8］。研究显示，肾脏氧化应激导致MAPK 活性增强进而诱发HN，抑制MAPK 活化可显著改善HN的肾损伤［9］。因此，调节肾脏的氧化应激对HN的治疗具有重要意义。

ESR 是一种孤儿受体，在肾脏等组织中广泛表达。在急性肾损伤中ESR 活性显著增强，同时伴随着凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3 表达增强及肾脏炎症反应；当ESR 活性被抑制时，肾细胞凋亡减少且炎症反应减轻［10］。以上结果表明，ESR 在HN 的治疗中可能具有重要意义。

肾脏是机体尿酸排泄的主要器官，ABCG2 是调节肾脏尿酸排泄的主要蛋白之一，ABCG2 功能障碍导致肾脏尿酸水平升高进而诱发HN，上调肾脏ABCG2 表达不仅能够降低机体尿酸水平，同时能够显著改善HN 大鼠的肾功能［11］。此外研究发现，ABCG2 是TP53 的 间 接 靶 点，抑 制TP53 可 导 致ABCG2 基因表达升高，进而增强肾脏尿酸排泄［12］。因此，以ABCG2 为靶点进行HN 的治疗具有重要的研究价值。

本研究通过GO 功能注释分析发现，香叶木素与HN 共有靶点的生物学作用主要包括对凋亡过程的正负调控、对细胞增殖的调控、线粒体功能、有机阴离子跨膜转运蛋白活性及尿酸的代谢等。这些生物学作用既是香叶木素的潜在活性作用，同时也是HN 的主要病理生理学过程，提示香叶木素具有治疗HN 的潜在价值。对共有靶点基因的KEGG 通路富集分析发现，香叶木素治疗HN 的可能通路为TP53 信号通路、PI3K/Akt信号通路、TNF 信号通路、NF-κB 信号通路等。TP53 被过量尿酸诱导的氧化应激激活，进而调节下游Bcl-2 家族及Caspase 家族相关蛋白的活性，控制肾脏细胞凋亡。与此同时，TP53 增强肾脏尿酸排泄蛋白ABCG2 的活性促进尿酸排泄进而改善肾功能［13］。此外，研究表明，尿酸通过激活PI3K/Akt/NF-κB 通路导致IL-1β、TNF-α、PTGS2 表达引发肾小管上皮细胞炎症反应［14］，而抑制PI3K/Akt/NF-κB 通路不仅能够降低肾脏尿酸重吸收蛋白GLUT9 表达，同时还能减轻过量尿酸诱发的肾脏炎症反应［15］。这表明香叶木素可能通过作用于以上多个通路发挥治疗HN的作用。

本研究进一步采用分子对接技术分别将香叶木素与核心靶点基因TP53、ABCG2、ESR1、PTGS2、BCL2L1、CASP8、MAPK1 和XDH 等基因编码的蛋白进行分子对接验证，结果显示，香叶木素与上述核心靶点蛋白的结合能均小于-5.0 kcal/mol，具有较强的结合活性。这进一步表明香叶木素可通过多靶点、多途径发挥治疗HN 的作用，同时也初步验证了网络药理学的分析结果。

综上所述，在HN 中，多靶点，多通路间相互作用，相互关联，共同影响HN 的发生和发展，而香叶木素可能通过调节多靶点、多通路发挥治疗HN 的作用。然而，尽管网络药理学突破单一靶点的研究模式，揭示了中药分子多靶点、多通路作用，为中医药的研究提供了极大的便利，但网络药理学仍存在诸多需要关注的问题：首先，网络药理学从现有的数据库中筛选信息，目前，用于数据筛选的数据库较多，尚无统一的规定，不同的研究人员在选择数据库时可能存在差异，因而筛选得到的数据具有差异性和不完整性；其次，中药成分复杂，经人体吸收后在多种代谢酶的作用下可能转化为其他活性物质且生物利用度及组织分布等无法准确判断，因此，具体药效成分需结合药效学及药动学的方法进行深入探究；此外，尽管通过数据库及其他计算机技术如分子对接等揭示了药物分子与疾病靶点存在联系，但二者间的具体作用仍需通过体内实验或体外实验进行验证，为药物的临床应用提供实验依据。