新疆伊犁河谷地区规模化猪场病毒性腹泻疾病检测与分析

王传锋 米青婕 皮志媛

（新疆伊犁职业技术学院，新疆伊犁 835000）

目前，猪场中以猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroEnteritis virus,TGEV）、猪轮状病毒（porcine rotavirus,PoRV）以及猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）等病毒性腹泻性疾病较为常见，主要引起仔猪的腹泻，成为危害养猪业的主要腹泻性传染性疾病，且在猪场中广泛流行，其感染率和死亡率均较高，严重影响养猪业发展[1,2]。而猪感染牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）后会出现类似慢性猪瘟感染症状及病理变化，引起许多消灭或控制CSF国家的高度预警，目前许多学者已逐渐关注。PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV等病毒性病原，其临床特征相似，临床上以严重腹泻、脱水和损伤仔猪的消化器官为主要特征，各阶段的猪均会感染，以仔猪较为严重，其致死率可高达80%以上，4种病毒性腹泻疾病在临床中常以混合感染为多见，临床中不易诊断，很难区分，给该病防控带来一定困难[3,4]。目前病毒性疾病没有有效药物可以治疗，主要通过疫苗免疫进行预防，其免疫不当，很大可能导致疾病的流行与发生，给养殖户造成严重的经济损失[5]。因此，应该注意PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV等疾病的疫苗免疫和猪场的净化，减少该病的发生与流行。

2021年从伊犁河谷地区规模化猪场采集患腹泻病猪的血液、粪便肠内容物等病料组织1 200份，检测5种病毒性腹泻疾病 （PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV）感染与流行情况，为该地区腹泻病毒性疾病综合防控提供参考基础。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2021年从伊犁河谷地区规模化猪场采集患腹泻病猪的血液、粪便肠内容物等病料组织共1 200份，其中，尼勒克县182份、新源县192份、巩留县201份、特克斯县162份、伊宁县173份、察布查尔县164份、霍城县126份。

1.2 主要试剂

质粒提取试剂盒、病毒RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒，均购自TAKARA公司；T载体、琼脂糖DNA回收试剂盒、DL-2 000 Maker、ExTaq DNA聚合酶均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 病料组织的处理

将采集粪便及肠内容物等病料组织进行处理，加入等量无菌的PBS中均浆，在-80℃反复冻融3～5次，离心后取上清，用0.2 μm滤纸过滤后加入1%双抗处理0.5 h，-80℃保存备用。

1.4 核酸的提取

血液分离血清后，直接用病毒RNA提取试剂盒提取，粪便及肠内容物等病料组织经过处理后，参照说明书病毒RNA提取试剂盒说明分别提取血清、粪便及肠内容物RNA，用逆转录试剂盒反转为cDNA，-80℃保存备用。

1.5 引物设计与和合成

参考文献[6]并参照GenBank中登录的基因序列，设计猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）以及牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等5种病原的特异性鉴定引物（引物序列具体见表1），引物由华大基因有限公司合成。

表1 5种病毒的引物序列

1.6 RT-PCR鉴定与测序

以提取病料组织的核酸为模板，分别加入合成的PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV等5种病毒的引物，用PCR方法分别检测其PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV阳性率（具体步骤按照RT-PCR说明书执行）。回收阳性样品的目的基因片段，按照说明书连接到T载体上后，提取质粒送华大基因公司进行测序，其测序结果与GenBank中登录的参考株进行同源性比对。

2 结果与分析

2.1 病毒RT-PCR检测结果

以提取的病料组织的核酸为模板，用RT-PCR分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV等5种病原。结果显示，PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV病原菌扩增出目的条带，分别为231 bp、342 bp、309 bp、1 100 bp、289 bp（见图1)，选择阳性样品连接T载体测序，其PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的测序结果与GenBank中登录的参考株比较发现同源性在97.0%～99.0%之间。

图1 病料组织的RT-PCR检测结果

2.2 PEDV、 TGEV、 PoRV、 PDCoV、 BVDV检测结果

利用 RT-PCR进行 PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV目的片段检测。结果由表2可知，2021年的伊犁河谷地区规模化猪场中PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV总阳性率分别为34.5%、7.4%、22.7%、2.9%、8.2%。其中PEDV和PoRV阳性率较高。

表2 PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV的检测结果

2.3 PEDV、 TGEV、 PoRV、 PDCoV、 BVDV多重感染检测结果

对2021年从伊犁河谷地区规模化猪场采集的1 200份样品，进行PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV阳性率的多重感染率统计分析，由表3可知，PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV等4种病原存在共感染情况，其中以二重感染为主，PEDV/TGEV和PEDV/PoRV二重感染，感染率最高，分别为7.2%、9.4%，说明该地区不同猪场中以二重感染为主。

表3 多重感染检测结果

3 讨论

猪场中病毒性腹泻是危害养猪业的主要传染性疾病之一，主要通过疫苗进行免疫，尤其是具有传染源和疫苗免疫不合理时均可以导致一些病毒性腹泻疾病的发生与流行，在流行过程中呈现隐性感染或者混合感染，给疾病的诊断和防控带来一定的困难[11,12]。因此，对猪场中病毒性腹泻疾病的净化与综合防控具有重要意义。本试验通过对2021年从新疆伊犁河谷地区规模化猪场采集的病猪血液肌及组织样品，进行 PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV等5种病毒性腹泻病原的检测。结果显示，PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV的总阳性率分别为34.5%、7.4%、22.7%、2.9%、8.2%，且以PEDV和PoRV阳性率较高，以二重感染为主，其中PEDV/TGEV、PEDV/PoRV二重感染率分别为7.2%、9.4%。说明该地区PEDV、PoRV流行率较高，可能与PEDV、PoRV 2种疫苗的免疫效果较差或者不合理有关，导致其阳性率较高。当前，国内养猪企业中，对PEDV、PoRV防控主要通过疫苗免疫来实现，同时疫苗免疫也是预防该病的主要方法，此外，需要注意母猪场中疾病的净化，防止带毒传播。本试验为该地区猪场中病毒性腹泻性疾病的防控提供参考依据。