115例胎儿NT厚度在其分布的95百分位数至2.9 mm之间病例产前遗传学检测结果分析

李萌萌，郝娜，周京，周希亚，蒋宇林，戚庆炜

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院产科中心，国家妇产疾病临床医学研究中心，北京 100730)

胎儿颈后透明层(nuchal translucency，NT)增厚与胎儿染色体异常以及致病性拷贝数变异(pathogenic copy number variants，pCNV)风险增加密切相关[1-3]，当NT增厚时应建议孕妇进行包含染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)检测在内的产前遗传学检测。目前临床上对于NT增厚切割值的选取尚未取得普遍的共识。国外的大多数研究以3.5 mm作为NT增厚的固定切割值[4-6]，但也有少量研究显示当NT在3.0～3.4 mm之间时，胎儿pCNV风险增加，建议应对其进行包含CMA检测在内的遗传学检测[7-8]。国内的研究基本以3.0 mm作为NT增厚的切割值。但国内外对于NT厚度位于其分布的第95百分位数(P95)至2.9 mm之间时胎儿染色体异常和pCNV的风险评估则基本缺乏。本研究通过对115例胎儿NT厚度在其分布的P95至2.9 mm之间患者的产前遗传学检测结果进行回顾性分析，探讨是否可将NT厚度在其分布的P95作为产前遗传学检测的切割值。

资料和方法

一、研究对象

选取2017年1月1日至2021年8月31日在北京协和医院就诊、妊娠11～13+6周行超声检查提示胎儿NT厚度介于其分布的P95至2.9 mm之间的孕妇共115例，包括在本院产检的孕妇以及外院高危转诊的孕妇。根据当时或中孕期的超声检查是否同时合并其他异常，将病例分为孤立性NT增厚和非孤立性NT增厚两组。孤立性NT增厚指在妊娠11～13+6周的超声以及之后的超声检查中均未发现其他异常；反之则为非孤立性NT增厚。所有患者均接受产前遗传学咨询，以及产前染色体核型分析和CMA检测，并根据检测后咨询决定是否继续妊娠。

二、研究方法

1.G显带染色体核型分析：胎儿的绒毛、羊水标本均于本院产前诊断中心实验室分拣处理，进行原位法细胞培养。绒毛标本经酶解后于37℃水浴，离心后加入培养液，在37℃、 5%CO2培养箱中培养，至细胞贴壁并形成多个集落后收获。羊水经离心后加入培养液，取 0.5 ml细胞悬液接种，在37℃、5%CO2培养箱中培养后收获。制片后行G显带染色和染色体核型分析，染色体显带水平为400条带。每例计数20个核型，分析5个核型。

2.CMA检测：绒毛、羊水基因组DNA通过Qiagen DNA Mini试剂盒(Valencia，美国)提取，DNA样本浓度经NanoDrop 2000仪(Thermo Fisher Scientific Inc，美国)进行测定，取吸光度A 260/280 nm在1.8～2.1之间的样本，转移至-20℃冰箱保存以进行后续实验。CMA检测使用CytoScan 750K芯片(Affymetrix Inc，美国)，数据分析使用ChAS 4.2(chromosome analysis suit)版本。

拷贝数变异(CNV)的分类解析参考国际公共数据库及发表文献，包括OMIM数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，http：//www.omim.org/)、DECIPHER数据库(Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources，https：//decipher.sanger.ac.uk/)、ClinVar数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、ClinGen剂量敏感数据库(ClinGen Dosage Sensitivity Map，https：//www.clinicalgenome.org)、UCSC(http：//genome.ucsc.edu/)及Pubmed。按照美国医学遗传学与基因组学(American College of Medical Genetics，ACMG)的相关指南对CNV进行分类。

3.病例资料收集：回顾性分析患者的临床资料，包括年龄、孕产次、孕中期胎儿超声检查、产前遗传学诊断结果等。

三、统计学分析

结 果

一、临床特点

115例患者平均年龄为(32.3±3.9)岁，其中高龄孕妇30例，占26.1%。孤立性NT增厚99例，占86.1%(99/115)；非孤立性NT增厚16例，占13.9%(16/115)，其中2例合并侧脑室增宽，6例合并颈背皮肤褶皱增厚，5例合并心脏异常，1例合并鼻骨发育不良，2例合并胎儿水肿。

二、介入性产前诊断情况

115例NT增厚患者均行产前诊断，其中绒毛活检(chorionic villus sampling，CVS)17例，羊膜腔穿刺98例。

三、产前遗传性诊断结果

1.孤立性NT增厚胎儿产前遗传学检测结果：在99例孤立性NT增厚胎儿中，有89例染色体核型分析及CMA检测结果均未见异常。对孕妇及其家属进行相应遗传咨询后，所有孕妇均选择继续妊娠，后续产前检查未见异常。

3例染色体核型分析和CMA检测结果均异常，占孤立性NT增厚病例的3.03%(3/99)，其中2例21三体，对孕妇及其家属进行相应遗传咨询后，孕妇选择终止妊娠；另有1例47，XXX，对孕妇及其家属进行相应遗传咨询后，孕妇选择继续妊娠，后续产前检查未见异常。

7例染色体核型分析结果正常，但CMA检出临床意义不明确的CNV，占孤立性NT增厚病例的7.07%(7/99)。对孕妇及其家属进行相应遗传咨询后，孕妇选择继续妊娠，后续产前检查未见异常。

2.非孤立性NT增厚胎儿产前诊断结果：16例非孤立性NT增厚胎儿中，3例染色体核型分析与CMA检测结果均异常，均为18三体，对孕妇及其家属进行相应遗传咨询后，孕妇选择终止妊娠。1例CMA检测结果为arr[hg19]18p11.32p11.21(136，227_12，441，861)×1，18q22.2q23(68，292，152_78，013，728)×1，提示胎儿在18p11.32p11.21区段存在12.3 Mb片段的缺失，在18q22.2q23区段存在9.7 Mb片段的缺失，均为pCNV；根据CMA结果回顾染色体核型，考虑胎儿核型为46，XN，r(18)(p11.31→q21)；对孕妇及其家属进行遗传咨询后，孕妇及其家属决定终止妊娠，遂于孕27周引产；对引产胎儿进行尸检发现胎儿眼距宽、人中短、全腭裂、左耳耳道闭锁、隐性脊柱裂、右足内翻和脑室部分狭窄，进一步病理检查提示双侧大脑神经元分布紊乱。其他12例病例染色体核型分析与CMA检测结果均正常。在非孤立性NT增厚患者中，共检出4例pCNV，占25.00%(4/16)，其中仅通过CMA检测发现的pCNV有1例，占6.25%(1/16)；此例虽然通过核型分析可以判断为18号的环状染色体，但其断裂点的判断依然需要通过CMA来确认，因此将其划分为仅通过CMA才能检出的pCNV。

对于胎儿NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之间的病例通过CMA检出pCNV情况见表1。

表1 胎儿NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之间时CMA检出pCNV情况(%)

讨 论

一、NT增厚与胎儿染色体异常和pCNV的关系

早孕期超声测量NT厚度已被广泛用于筛查胎儿染色体异常、pCNV、胎儿结构异常(主要是胎儿先天性心脏异常)[1，9-11]。约20%的NT增厚胎儿存在染色体异常[12]，文献报道，当NT厚度在其分布的P95以上时，胎儿罹患染色体异常的几率为20%～30%[12-13]，其发生率随NT厚度的增加而增加；NT厚度在其分布的P95和P99之间时，胎儿染色体异常的发生率为7%；NT厚度在3.5～4.4 mm时，胎儿染色体异常的发生率为20%；NT厚度在5.5～6.4 mm时，胎儿染色体异常的发生率为50%；NT厚度在8.5 mm以上时，胎儿染色体异常的发生率为75%[12]。Yang等[14]对296例NT>3 mm的病例进行核型分析，发现19.9%(59/296)的病例存在染色体异常。Scott等[15]对120例NT>6.5 mm的胎儿进行研究，发现74%的胎儿存在染色体异常。

大量研究证明NT的增厚也与胎儿pCNV有关[1-3，9，16-20]。Grande等[2]对NT增厚、胎儿染色体核型正常病例进行CMA检测的文献进行系统回顾和荟萃分析，结果显示有额外5%的病例可通过CMA检测获得遗传学诊断(95%CI：2.0-8.0)；对于孤立性NT增厚的病例，有额外4%的病例可通过CMA检测获得遗传学诊断(95%CI：2.0-7.0)；对于非孤立性NT增厚的病例，则有额外7%的病例可通过CMA检测获得遗传学诊断(95%CI：2.0-12)。最常见的pCNV是22q11.2缺失、22q11.2重复、10q26.3缺失和12q21q22缺失。Bornstein等[3]对3 314例染色体核型正常胎儿的高危指标进行评估，这些高危指标包括：(1)NT异常(>3 mm)；(2)有主要结构畸形；(3)超声软指标异常，研究发现当NT超过3 mm时pCNV的发生率为4.3%。上述研究结果提示，应对NT增厚胎儿进行产前染色体核型分析和CMA检测，并给予相应遗传咨询。

二、不同NT增厚切割值的胎儿染色体异常和pCNV检出情况

NT是指胎儿颈后的皮下液体积聚，通常在妊娠11～13+6周时可经超声观察到。NT的厚度受孕周影响，这也是胎儿正常发育的一部分。仅当NT的厚度超过一定切割值时才考虑其为异常[21]。以往的文献中对于NT增厚的定义存在很多不同的意见，也有多种关于NT增厚切割值的定义。究竟是以单一的切割值(如3 mm或3.5 mm)，还是以NT分布的P95或P99作为切割值，仍然存在较多争论。对于NT的分布而言，胎儿不同头臀长(crown-rump length，CRL)所对应的NT值的分布范围是不同的。研究表明，当胎儿CRL为45 mm时，其NT分布的P95对应的厚度为2.1～2.2 mm，NT分布的P99对应的厚度为2.8 mm；当胎儿CRL为84 mm时，其NT分布的P95对应的厚度为2.7～2.8 mm，NT分布的P99对应的厚度为3.4 mm[6]。

国外绝大多数研究都以3.5 mm作为固定的切割值，即当胎儿CRL在45～84 mm之间时，如果NT厚度≥3.5 mm，需要对胎儿进行产前遗传学检测[20，22-25]；而针对3.5 mm以下NT厚度病例的研究则很少。Petersen等[8]对丹麦中央区和荷兰鹿特丹地区胎儿NT厚度在3.0～3.4 mm之间的两个队列的病例进行回顾性研究，一共有552例病例被纳入研究。结果显示，胎儿染色体异常的风险为1∶7.4(13.5%，95%CI：8.2%-21.5%)，其中69.1%的病例为胎儿13、18、21三体，可以通过无创产前检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)被筛查出来；但有16.2%的病例为性染色体异常或>10 Mb的染色体不平衡性重排，有14.7%的病例只能通过CMA被检出CNV(其中90%为pCNV)，这些病例是无法通过NIPT被筛查出来的。作者提出，对于NT厚度在3.0～3.4 mm之间时，胎儿染色体异常的风险大于1∶10。按照目前国际妇产科超声协会(ISUOG)关于NIPT的共识意见，对于染色体异常风险大于1∶10的高风险孕妇，不应对其进行NIPT检测，应对这部分病例进行包含CMA检测在内的产前遗传学检测[26]。

对于胎儿NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之间的病例则鲜有研究。Maya等[7]对2011年11月到2015年11月期间以色列的数个医学中心对孤立性NT增厚病例的产前遗传学检测结果进行回顾性分析，其研究目的是评估NT厚度在3.0～3.4 mm之间是否可以作为产前CMA检测的适应证。一共有770例病例被纳入研究，作者将其分为3组：A组为NT≤2.9 mm的病例，作为正常对照组，共462例；B组为NT厚度在3.0～3.4 mm之间的病例，共170例；C组为NT≥3.5 mm的病例，共138例。所有病例均进行产前染色体核型分析和CMA检测，3组中pCNV的检出率分别为1.7%、6.5%和13.8%。在这项研究中，作者是将所有NT≤2.9 mm的病例作为正常对照组，其pCNV的检出率为1.7%，和其他文献[27]报道的超声正常胎儿的pCNV检出率相似，但作者并没有针对NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之间的病例进行分析。

本研究对115例NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之间的病例进行包含CMA检测在内的产前遗传学检测。在孤立性NT增厚的99例病例中，共检出3例异常病例，均为染色体非整倍体，其中2例为21三体，1例为47，XXX，胎儿染色体非整倍体的发生率为3.03%(3/99)，高于背景人群发生率[28]。结果显示在该组人群中，胎儿染色体非整倍体风险增加，但仅通过CMA才可以检测到的pCNV风险并不增加。在非孤立性NT增厚的16例病例中，共检出4例异常病例，其中3例为18三体，通过染色体核型分析和CMA均可检出；1例pCNV仅通过CMA检出，胎儿在18p11.32p11.21区段存在12.3 Mb片段的缺失，在18q22.2q23区段存在9.7 Mb片段的缺失，均为pCNV，最终根据CMA结果回顾染色体核型，考虑胎儿核型为46，XN，r(18)(p11.31→q21)。此例虽然通过核型分析可以判断为18号的环状染色体，但其断裂点的判断依然需要通过CMA检测来确认，因此将其划分为仅通过CMA检测才能检出的pCNV。在非孤立性NT增厚的病例中，染色体异常总体发生率为25%，而仅通过CMA检测检出的pCNV发生率为6.25%，提示在非孤立性NT增厚的病例中，胎儿染色体非整倍体和pCNV的风险均增加。

有研究表明胎儿pCNV的发生率与孕妇年龄无关，为1/270[29-30]。在Wapner等[27]的前瞻性研究中，不合并超声异常的胎儿pCNV发生率为1.7%。Callaway等[31]对12 362例产前CMA检测的病例进行回顾性分析，对于不合并超声异常的病例，包括孕妇高龄、血清学筛查高风险人群中或者是孕妇焦虑要求进行产前CMA检测群体中，pCNV发生率分别为1.0%和1.1%。综合以上研究，不合并超声异常的胎儿pCNV的发生率在1.0%到1.7%之间。本研究中非孤立性NT增厚组的pCNV检出率明显高于不合并超声异常的胎儿pCNV的发生率。

本研究结果显示，对于NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之间的病例，孤立性NT增厚时胎儿染色体非整倍体风险增加，而在非孤立性NT增厚病例中，胎儿染色体非整倍体和pCNV的风险均增加。建议以NT厚度在其分布的P95作为NT增厚的切割值，对胎儿进行产前遗传学检测，尤其是对于非孤立性NT增厚的病例，建议进行包含CMA检测在内的产前遗传学检测。而对于孤立性NT增厚的病例，胎儿染色体非整倍体风险增加，但非整倍体类型除了21三体之外，也包括性染色体异常，因此不宜采用NIPT进行筛查，建议对其进行产前遗传学检测，至少进行染色体核型分析，是否需要对此类病例进行产前CMA检测，尚需进一步积累病例进行研究。

三、本研究的不足之处

本研究的数据来源于单个产前诊断中心，且其中部分病例来自于外院高危转诊。一方面由于病例样本数较少；另一方面，涉及的人群较为混杂，不是背景人群，因此本研究并没有计算NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之间的发生率。

虽然病例数有限，但研究结果显示，当NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之间时，胎儿染色体异常风险增加，建议将NT厚度在其分布的P95作为NT增厚的切割值，对胎儿进行产前遗传学检测。当NT增厚为非孤立性表现时，胎儿染色体非整倍体及pCNV风险均升高，产前遗传学检测的方案应包含CMA检测；当NT增厚为孤立性表现时，胎儿染色体非整倍体异常风险增加，但pCNV风险并不增加，产前遗传学检测方案至少应包含产前染色体核型分析，是否需要进行CMA检测尚需进一步积累病例进行研究。