器官芯片在肾脏疾病研究中的应用

黄 威 陈怡园 综述 何方方 审校

器官芯片是一种在芯片上模拟器官功能的微系统,以微流控技术为核心,与细胞生物学、生物材料和工程学等多种方法相结合,是近几年快速发展的前沿科学技术,已广泛应用于疾病研究、新药筛选和毒性预测[1]。在肾脏领域,器官芯片主要用于构建体外模型,以研究肾脏疾病的发病机制。此外,在新药临床试验中,肾脏芯片凭借其高仿真性被视为良好的体外模型,成为新药研发领域的研究热点[2]。本文通过追溯微流控技术在肾脏病领域的应用案例,阐述器官芯片在肾脏疾病中的应用进展,探讨肾脏芯片的发展前景。

器官芯片简介

发展史自20世纪90年代以来,微流控技术与医学领域交叉衍生出多种新技术,器官芯片即为其中之一[3]。器官芯片是一种微流体细胞培养装置,可模拟器官的关键功能单元和微环境要素。之所以被称为“芯片”,是因为其最初是利用制造计算机芯片的方法制备的[4]。2010年,Huh等[5]研制出第一个器官芯片——肺芯片,标志着器官芯片初级功能化的实现。该研究发表以来,多个研究小组相继构建出肝、肠、胎盘、肾脏等器官芯片[4],涉及药物研发和疾病研究等多个领域。

组成器官芯片是通过2D或3D培养方式将细胞培养于由单个至多个微通道组成的微流体装置中,微通道中多孔膜的两侧可分别培养不同类型的细胞,再给予物理或化学信号刺激,以模拟体内的3D环境[4,6-7]。

优缺点器官芯片技术可使用人类来源的细胞,还能提供液体流动、机械信号以及器官水平的组织界面,能更真实地模拟人体器官的三维结构和生理环境[2]。此外,器官芯片可模拟器官的最小功能单元,所需材料少,可实现大量样本的并行实验[8]。由于装置的光学透明性,研究者可直接在细胞水平观察生理活动,这在活体器官中很难做到[9]。器官芯片可对各腔室分别进行研究,还可单独调整培养参数,为研究分子、化学和物理信号如何单独或组合发挥作用提供了工具[4]。

器官芯片也存在局限性。例如,目前器官芯片最长培养时间约为4周,不适用于某些耗时较长的实验[10]。灌注流体通道中常出现气泡或灰尘,由于装置尺寸较小,这些物质很难去除,可能会影响实验结果[9]。另外,不同制造商或不同实验室制作出的器官芯片存在性能上的差异,影响实验的均一性[4]。

肾脏芯片的应用

肾小管芯片肾小管芯片由血液极块、尿液极块及两者间的多孔膜组成,极块多以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为材料,多孔膜两侧分别种有血管内皮细胞和肾小管上皮细胞,血液极块中的液体流经血管内皮细胞,尿液极块的液体流经肾小管上皮细胞,两条通路中的成分通过多孔膜进行交换,能有效模拟肾小管的功能(未发表资料)。

药物肾毒性评价 近端小管是药物清除的主要部位,也是药物肾毒性的主要靶点,但动物实验的局限性使得药物的肾毒性常在临床试验晚期才被发现,由于肾小管芯片能更准确及时地评估肾小管受损程度,目前可用于药物筛选与药代动力学研究。

Jang等[11]将顺铂流动状态与静态的肾毒性进行比较,结果表明,在流动状态下,顺铂诱导的肾小管毒性明显低于静态,这可能是临床上通过液体输注预防顺铂肾毒性的原理。Kim等[12]设计了一种肾小管芯片研究庆大霉素的肾毒性。研究者以相同剂量,分别通过1次/d大剂量和连续输注两种方法给药,结果显示前者可降低细胞毒性,并使上皮细胞保持低渗,证明庆大霉素的肾毒性与其给药方式相关。Alder等[13]在体外将人近端小管上皮细胞(HPTECs)暴露于肾毒性物质后进行多基因表达谱分析,发现只有编码血红素加氧酶1的基因过表达与毒性物质剂量增加有关,该研究成功利用肾小管芯片发现了新的肾毒性生物标志物。这些研究成果提示肾小管芯片在新药筛选和毒性预测方面具有很大的潜力。

模拟肾纤维化 肾纤维化的形成机制尚无定论,有研究显示上皮-间充质转分化(EMT)可能在此过程中发挥重要作用[14],但缺乏可监测EMT过程的体外模型。为此,Zhou等[15]利用人肾小管上皮细胞(HK-2)制备肾小管芯片重现了EMT过程。研究者在流体状态下观察到暴露于血清蛋白的HK-2出现类似于体内EMT的过程。该实验在上皮细胞周围建立与体内类似的微环境,这是传统方法无法实现的。

模拟肾结石形成 关于结石形成机制,既往研究主要通过提取结石的成分间接得出结论,缺乏真实的动力学因素,对其机制的研究难以深入[16]。Wei等[17]将HK-2培养于管状微流体装置中,在显微镜下原位监测磷酸钙在小管中的沉积,以观察结石形成的生物学过程。结果发现,当腔内钙浓度增加时,细胞内钙浓度也随之增加,而将氯化钙和磷酸三钠的混合溶液注入装置时,可观察到磷酸钙结石的形成。这是首个通过实时诱导肾小管结石形成来研究其产生机制的研究。

肾小球芯片肾小球芯片的构建与肾小管芯片类似,多孔膜上涂有基质,两侧为原代肾微血管内皮细胞与足细胞,形成肾小球滤过屏障(GFB),当液体通过时可模拟体内血液滤过的过程(图1)。体外培养足细胞难度较大,限制了肾小球芯片的发展,但由多能干细胞衍生的足细胞的出现有望克服这一难题[19]。

图1 肾小球芯片示意图PDMS:聚二甲基硅氧烷;肾小球芯片由PDMS制作而成,模型中的上下层液体流通通道与外界液体相连,两层之间由有孔的基膜分隔开,上层模拟血管腔,种有血管内皮细胞,下层模拟尿液腔,种有足细胞,上层液体可经基膜流入下层,这三层结构可模拟肾小球滤过屏障

模拟糖尿病肾病(DN) DN是终末期肾病的主要原因,但其发病机制目前尚无定论[19]。Wang等[20]制备了一种肾小球芯片模拟DN,结果显示,高血糖时肾小球对白蛋白的通透性显著增加,葡萄糖转运体1表达增加,活性氧产生增加,但紧密连接蛋白1表达减少,证明该芯片成功模拟DN的病理生理过程,为DN发病机制的研究提供了新的思路。

模拟高血压肾病(HN) 目前,关于HN的研究一直缺乏能调节机械力的体外模型。Zhou等[21]设计了一种肾小球芯片,可通过调节血流动力学因素制备HN模型。该装置由毛细血管通道和衬有足细胞的尿路通道组成,当培养基流过毛细血管通道时,会产生纵向流体剪切应力模拟肾小球的滤过作用,在此基础上增加流速会导致毛细血管压力增加,形成类似HN的病理状态。结果表明,当流速增加时,细胞内形成应力纤维,血管内皮受损,足细胞标志分子nephrin和podocin的表达降低,GFB对白蛋白的通透性显著增加。这些结果表明肾小球芯片可用于研究HN的机制。

肾单位芯片单独的肾小管芯片和肾小球芯片只能模拟肾单位的部分功能,得到的数据可能较为片面。为更全面的模拟肾单位的结构和功能,需要构建完整的肾单位芯片。肾单位芯片包含肾小球与肾小管装置,肾小球装置由上下两个腔室构成,分别模拟肾小球和包囊,中间多孔膜两侧种有肾微血管内皮细胞和足细胞,液体中的物质可由肾小球过滤至包囊,模拟滤过作用;同样,肾小管装置分为管周毛细血管和小管腔,多孔膜两侧分别种有血管内皮细胞和肾小管上皮细胞,液体成分可由后者转运回前者,类似重吸收过程。再将肾小球与管周血管、包囊与小管腔分别以微通道相连,形成完整的流动系统,从而实现了功能性肾小球和肾小管的共培养[22](图2)。

图2 肾单位芯片示意图肾单位芯片由肾小球和肾小管两部分装置组成,上层血管腔模拟肾小球微血管和管周毛细血管,种有血管内皮细胞;下层尿液腔模拟尿路通道,肾小球部分种有足细胞,而肾小管部分分别种有近端小管上皮细胞和集合管细胞,上下两层通道中的液体可经有孔的基膜相互交通,该芯片可模拟肾小球的滤过功能和肾小管的重吸收和内分泌功能

药物肾毒性评价 有研究者构建了一种肾单位芯片,该芯片的肾小球单元具有机械屏障和电荷屏障作用,肾小管单元可重吸收葡萄糖、分泌对氨基马尿酸,证明该芯片具有良好的仿真性(未发表资料)。研究者利用该装置考察肾单位对顺铂的响应情况,发现当顺铂分别施加于小管与顶端膜时,细胞损伤程度有差异,并且管周血管内皮细胞对顺铂诱导的肾损伤有保护作用,这些结果与体内情况相似。实验还比较了顺铂对肾单位芯片和肾小管芯片中小管上皮细胞损伤程度的差异。在同等给药情况下,肾单位芯片损伤程度更轻,说明利用肾单位芯片进行药物筛选可能比肾小管芯片更加真实可靠。

模拟肾毒性 有研究者将大鼠原代足细胞、血管内皮细胞和肾小管上皮细胞按照一定比例接种在芯片上,研究中草药商陆有效成分商陆皂苷甲对肾脏细胞的损伤(未发表资料)。结果表明,该芯片能较好地维持大鼠原代肾脏细胞的生长状态,通过染色表征不同浓度的商陆皂苷甲对肾脏细胞的损伤情况,成功实现了对中草药成分的肾毒性筛选。

包含肾脏功能的多器官芯片体内各器官间的相互作用在单器官芯片中难以实现,使得多器官芯片逐渐引起了研究人员的重视[23-25]。包含肾脏在内的多器官芯片不仅在药物代谢与疾病建模方面具有良好的发展潜力,还可研究器官间的相互关系。

在药代动力学中的应用 药物在小肠中吸收、肝脏代谢以及肾脏排泄的过程决定了其疗效和安全性。为研究多器官的系统性反应,Maschmeyer等[10]在4个培养室中分别接种人源性细胞构建肠、肝、肾小管和皮肤类似物,再将肠、肝和皮肤腔室相连形成血流回路,肾腔和微通道相连形成排泄回路。肠腔允许药物吸收,肝室能进行物质代谢,肾腔可排泄药物,皮肤隔室可用作替代吸收途径(图3)。该芯片实现了四种器官的共培养,可用于检测特定药物的药代动力学,包括吸收、分布、代谢和排泄情况,这也是第一个在体外利用微流控模型对药物进行全身毒性测试的研究。

图3 多器官芯片示意图[10]该多器官芯片由四部分组成,可模拟药物的吸收、分布、代谢和排泄过程;肠腔由人原代小肠上皮细胞构建,模拟药物的肠道吸收过程;皮肤隔室由人活检皮肤组织构建,模拟药物的皮肤吸收过程;肝室由肝癌细胞和人原代肝星状细胞组成的肝脏类似物,模拟药物的代谢过程;肾腔由人近端小管上皮细胞株构建,模拟代谢产物的排泄过程;红色为血流回路,黄色为排泄回路

器官间的相互作用 Zhang等[26]开发了一种包含肝脏、肺脏、肾脏和脂肪细胞的微流控装置。四个培养室相互串联,不仅能模拟器官间的联系,还能实现功能分离。实验证明转化生长因子β1可激活肺隔间中的细胞,而不损害其他器官的功能。Choucha-Snouber等[27]设计了一种肝肾共培养器官芯片,即在两个培养室中分别培养肝细胞和肾细胞,肝室中的培养基可流入肾室,在肝室内形成的异环磷酰胺代谢物氯乙醛可使肾细胞的数量显著减少,证明了肝脏代谢产物氯乙醛的肾毒性。由此可见,多器官芯片能揭示器官间的相互作用。

总结与展望

器官芯片作为一种新兴技术,凭借对组织器官的准确模拟和对实验参数的精确调控,已逐渐应用于多个医学领域。与肾脏领域的交叉,为药代动力学研究和肾脏疾病模型的建立注入了新的动力。目前的肾脏芯片尚存在诸多不足,但在提高肾脏结构功能的认识及对肾脏疾病的个性化治疗等方面仍然具有很大帮助[28]。

现有肾脏芯片主要由单一的细胞类型组成,而肾脏的许多功能与心脏、肝脏、肺和肠道等远处脏器密切相关,肾脏与这些脏器的相互作用也是心肾综合征、肝肾综合征等一些疾病的发病基础[29-30],所以单一的肾脏芯片可能无法完全真实地反映肾脏疾病的发生发展,提示包含肾脏的多器官芯片可能是未来的研究热点。