脂肪组分染色质免疫共沉淀研究方法的建立

许 昆 张 静 杨敬平 刘志红

染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)[1-2]是一种常用的分子生物学技术,用于检测脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)-蛋白质相互作用。它基于与目标蛋白质相互作用的DNA富集,从而确定各种转录因子(transcription factors, TF)[3]、组蛋白[4-5]和其他蛋白质[6]结合位点的位置。TF结合位点和共价修饰组蛋白的全基因组分析对于拓宽对基因组如何部署以实现特定基因调控的理解至关重要。ChIP与随后的高通量测序分析(ChIP-sequence,ChIP-seq)相结合[7-9],已成为识别全基因组蛋白质结合位点和了解蛋白质在细胞身份基础上发挥作用最泛用和最有效的方法。影响ChIP实验的因素有很多,如组织或细胞的类型、样品的起始量、抗体质量和获取的染色质质量等。因此,有必要优化每种组织或细胞类型的染色质制备方案,以提高ChIP实验质量。

脂肪是代谢过程中能量储存和产热的组织[10],同时在免疫过程中释放炎症因子,还可以通过分泌脂肪因子在内分泌系统中发挥作用[11-13]。这归因于脂肪细胞组成包括了成熟脂肪细胞以及血管基质组分(stromal vascular fraction, SVF)细胞[14]。成熟脂肪细胞中大量的油脂使得脂肪组分的ChIP实验极具挑战,导致细胞组分分离和从细胞中回收DNA的过程特别困难。此外,由于某些部位脂肪组分细胞数量有限,ChIP应用受限。因此研究人员更倾向于仅在组织水平研究体内脂肪[15]或仅研究能够提供足够样本量的部位,如性腺脂肪[16-17]。为了研究特定的脂肪组分和每个脂肪部位,有必要提高脂肪组分的染色质数量和质量。本研究对不同部位脂肪的两个细胞组分的ChIP实验方法进行了一系列优化,以获得更多更高质量的染色质。

对象和方法

研究对象选择12周龄的C57BL/6J雄性小鼠, 用浓度为0.2%～0.5%的一氧化碳对小鼠进行安乐死,随后使用颈椎脱位确认安乐死,并立即解剖样品。以75%乙醇对小鼠进行消毒,并确认小鼠表面足够湿润,以减少皮毛对解剖的污染。

不同部位脂肪组织的解剖和获取分离棕色脂肪组织(brown adipose tissue, BAT),将小鼠置于俯卧位,用解剖针固定其四肢。然后提起颈部皮肤,沿脊柱至背部中段做垂直切口。剥离皮肤露出肩胛间脂肪库,剪下蝴蝶形的BAT,去除表面的白色脂肪组织。

分离腹股沟下脂肪组织(inguinal adipose tissue, IAT),将小鼠置于仰卧位并固定四肢。提起胸骨底部的皮肤,从胸骨底部到尾根部做垂直切口。剥离腹、腿部的皮肤,露出与皮肤相连的三角形的IAT并切除。

分离性腺脂肪组织(gonadal adipose tissue, GAT),提起腹膜,从胸骨底部到直肠底部做垂直切口。剥离腹膜后,找到睾丸并用提起GAT,仔细切除脂肪组织,避开睾丸、附睾和血管。

肾周脂肪组织(perirenal adipose tissue, PRAT) 环绕双侧肾脏。先将肾脏提起并拉至中线,辨认PRAT与其后方的腹膜后脂肪组织(retroperitoneal adipose tissue, RAT)之间的分界线。切除与肾脏直接相连的脂肪组织,并确保将肾脏上方的肾上腺从脂肪中剔除。

RAT位于脊椎两旁,沿着腹膜后壁和脊髓之间的边界分布。在切除PRAT后,使用虹膜剪小心地从腹膜后壁上将其切除。

组织消化解剖完成后将脂肪组织转移至装有磷酸盐缓冲冰盐水(phosphate buffered saline, PBS)的5 mL离心管中,剪成<1 mm的组织块,再转移至15 mL离心管中,加入适量胶原酶Ⅰ(2 mg/mL)解离缓冲液。组织消化在恒温37℃摇床(EZ ThermoShake)进行,转速100 r/min,30～40 min,消化至看不见组织颗粒的匀浆状态时,加入含10%新鲜胎牛血清的细胞培养基3 mL 终止消化。匀浆过滤后在4℃、500 g的条件下离心8 min。

ChIP-seq实验按文献方案进行[18]。Sonics VCX-130用于超声片段化染色质,参数设置为每个循环开启30 s,关闭30 s,共15次循环。使用2 μg抗体[组蛋白H3赖氨酸27的乙酰化(H3K27ac),Abcam,ab4729;组蛋白H3赖氨酸4的三甲基化(H3K4me3),Abcam,ab8580]进行免疫沉淀。使用DNA Clean & Concentrator-5试剂盒(ZYMO)进行纯化 DNA。使用NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (E7370)为ChIP样品构建文库,并由安诺优达基因科技(北京)有限公司在HiSeq4000上进行测序。

ChIP-seq的分析流程每个样本获得的数据,使用cutadapt[19]1.18 版本去接头,并使用参数“--no-mixed”和“--no-discordant”与 bowtie2[20]2.3.0版本与参考序列进行比对。SAMtools[21]1.3.1 版本、Picard 中的MarkDuplicates和 bedtools 2.25.0 版本用于去除比对后数据中的重复。 MACS2[22]2.1.2 版用于基因组范围的结合峰寻找,参数“--broad”专门用于 H3K27ac 的峰。bedGraphToBigWig4.0版本用于将bedGraph文件转换为BigWig文件。

统计学方法采用《R软件4.0.3》进行数据计算。成熟脂肪细胞、SVF细胞优化前后DNA含量的比较采用配对t检验。ChIP-seq数据优化前后峰的个数和FRIP分数的比较采用配对t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

各部位脂肪组织的解剖顺序获取新鲜的组织或细胞是ChIP实验的第一步。因此必须快速进行解剖以保持染色质的完整性。我们按照BAT、IAT、GAT、PRAT和RAT的顺序解剖了小鼠的脂肪库(图1A),5min左右即可完成一只小鼠的五次解剖,至少节省50%时间。

SVF细胞分离方法的优化经过解剖、消化和离心的步骤后,获得了含有新鲜脂肪组分的三层溶液。顶层含有成熟脂肪细胞,中间层是解离缓冲液,底部沉淀含有SVF细胞(图1B)。为了分离成熟脂肪细胞和SVF细胞,需要将三层分离开来。通常的做法是,将顶层成熟脂肪细胞用移液枪转移到新的离心管中,丢弃中间层,随后将底部的SVF细胞重悬并留置在管中。按照上述实验方法,转移脂肪层后大量的油脂牢固地附着在管壁上,在固定过程中油脂将与SVF细胞混合并牢固地附着在其细胞膜上(图1C)。在超声裂解染色质的过程中,附着在细胞膜表面的油脂会重新释放到缓冲液中,干扰超声效率,SVF细胞的染色质片段会变得过长或过短,同时因为背景噪声高导致ChIP结果不佳。

为了避免出现上述问题,本研究优化了SVF细胞的分离。去除顶层和中间层后,先用200 μL PBS快速重悬管底的SVF细胞,然后迅速转移到新的离心管中,避免从离心管壁中带出任何油脂(图1C)。该转移步骤的添加显著减少了油脂污染。超声处理后含有染色质片段的缓冲液不再被油脂污染,变得清晰透明(图1D)。 DNA片段大小大致正常分布,长度为200～500 bp,适合后续高通量测序(图1E)。

图1 防止SVF细胞被油脂污染的实验方法的优化BAT:棕色脂肪组织;IAT:腹股沟下脂肪组织;GAT:性腺脂肪组织;PRAT:肾周脂肪组织;RAT:腹膜后脂肪组织;SVF:血管基质组分;BP:碱基对;横轴:片段的大小;纵轴:荧光定量;A:按① BAT ② IAT ③ GAT ④ PRAT ⑤ RAT 的顺序进行解剖;B:离心后分层,从上到下依次为成熟脂肪细胞、解离缓冲液和SVF细胞;C:优化前:由于油脂牢固地附着在管壁上,SVF细胞在后续操作中会受到污染;优化后:使用小体积重悬进行额外的转移来避免油脂污染;D:优化前:被油脂污染的染色质溶液呈白色混浊;优化后:获得的染色质溶液清晰透明,无油脂污染;E:优化实验方法中获得的DNA片段的大小分布;此结果是使用LabChip Touch获得的

增加成熟脂肪细胞染色质数量方法的优化获得成熟脂肪细胞后,继续进行固定和洗涤。原始实验方法中,每次进行离心后,都是使用移液枪直接将漂浮在顶部的成熟脂肪细胞转移到新的离心管中(图2A)。由于成熟脂肪细胞的低表面张力和高黏度,细胞倾向于留在缓冲液中或黏在管壁和移液枪吸头上,在转移过程中细胞损失很高。

为了减少细胞损失,本研究选择抽出下层缓冲液,将成熟脂肪细胞留在原离心管中,不进行转移。由于成熟的脂肪细胞会黏附在移液枪吸头上,改用5 mL注射器来进一步防止细胞损失(图2B)。在原管中进行固定和三次洗涤,直到细胞溶解。通过这些优化步骤,可以获得更多的成熟脂肪细胞,其DNA获得量的增长率为117.2%～150.0%(图2C,表1)。

提高SVF细胞染色质回收率方法的优化除了成熟脂肪细胞,本研究还尝试提高 SVF细胞染色质的回收率。在原始方案中,在获得SVF细胞后通常对SVF组分进行红细胞裂解的操作,可能对其他细胞类型造成潜在伤害。由于成熟的红细胞没有细胞核,本研究直接省略红细胞裂解步骤。改进后观察发现,SVF细胞的染色质回收率显著增加,其DNA获得量的增长率为54.8%～223.7%(图2D,表1)。

图2 增加成熟脂肪细胞和SVF细胞的染色质数量DNA:脱氧核糖核酸;SVF:血管基质组分;H3K27ac:组蛋白H3赖氨酸27的乙酰化;H3K4me3:组蛋白H3赖氨酸4的三甲基化。A:成熟脂肪细胞的原始转移方法导致细胞大量损失;B:优化的实验方法将使成熟脂肪细胞的数量增加到两倍以上;C:成熟脂肪细胞ChIP-DNA条形图;D:SVF细胞ChIP-DNA条形图;*:与优化前比较,P<0.05

表1 实验方法优化前后的样品和ChIP-DNA的相关信息

代表性结果通过优化的实验方法,对制备完成的ChIP库进行测序和分析。结果显示在SVF细胞标记基因座 Pecam1、Cd34和Cd14以及在脂肪细胞标记基因座Dock6、Pck1和Adipoq的显著 H3K27ac信号(图3A)。使用优化的实验方法检测到更多高质量的峰和更高的峰读数(FRIP)分数(图3B)。对于成年雄性小鼠PRAT的成熟脂肪细胞,使用优化的实验方案确定了29 282个高置信度峰,其中 46.02%的峰位于启动子中,24.48%位于内含子中,19.29% 位于远端基因间区域。对于SVF细胞,使用优化的实验方案确定了27 203个高置信度峰,其中 47.61%的区域位于启动子中,25.49%位于内含子中,17.48%位于远端基因间区域(图 3C)。这些结果表明,对脂肪组分的ChIP优化方案是有效的,实验方法同样适用于体积重量有限的脂肪库。

图3 优化实验方案后获得的组蛋白图谱SVF:血管基质组分;UTR:非翻译区;A:从SVF细胞(左)和成熟脂肪细胞(右)的 H3K27ac 的ChIP-seq数据生成的标准化bigwig格式文件。Pecam1、Cd34、Cd14(SVF细胞的标记基因)、Dock6、Pck1 和Adipoq(脂肪细胞的标记基因)基因座的基因组浏览器视图;B:ChIP-seq数据的峰的个数和FRIP分数的条形图;条形图表示2次重复的样本平均值;与优化前比较,*P<0.05,**P<0.01;C:成熟脂肪细胞和SVF细胞的H3K27ac的ChIP-seq峰的全基因组分布

讨 论

获得高质量染色质是ChIP-seq面临的挑战之一。本文优化了从脂肪组分中制备ChIP实验所需染色质实验方案,减少了脂肪细胞损失,可防止油脂污染并提高体积重量有限的脂肪组分中染色质的质量和数量。

使用优化的实验方法,我们从4只小鼠的5个脂肪库中获得了ChIP实验所需的足够的染色质,并获得了高质量的成熟脂肪细胞和SVF细胞组蛋白修饰图谱。与已发表的文献相比,在将每一只小鼠作为一个独立样本进行研究的前提下,研究者更倾向选用GAT这种含量丰富的脂肪组织作为研究材料[16-17],而本实验方法对体积重量有限的脂肪组织尤其奏效。例如,与肥胖相关的BAT在每只成年雄性小鼠体内仅有0.15g[23];在解剖中发现,与肾脏疾病相关的PRAT数量更少,一般每只成年雄性小鼠体内仅有0.1g左右。然而本文通过优化的实验方法,成功地对BAT和PRAT组分进行ChIP-seq,以进一步了解其在肥胖和其他相关疾病中的作用。同样,本实验方法也可用于有限的体内脂肪组织细胞组分的研究,不使用体外生长的诱导细胞系。因此,本结果为研究珍贵的稀有脂肪组分的表观遗传学提供了更好的选择。

在富含油脂的组织或细胞类型的ChIP实验中,防止细胞被油脂污染同样重要。除了脂肪组织,来自肥胖动物的其他组织,如肝脏含有的大量油脂,可能会干扰后续实验。通过本文优化的实验方法,可以获得没有油脂污染的高质量染色质,并得到高信噪比的表观遗传图谱以供进一步研究。

总之,本研究优化了ChIP实验方法,可以更好地对体积重量有限和富含油脂的脂肪组分进行表观遗传学研究,为后续研究脂肪组织相关疾病如肥胖、糖尿病肾病等提供了可行的实验方案。