病原体宏基因检测在肾脏疾病使用免疫抑制患者中的应用

李世军

肾脏疾病患者因长期使用糖皮质激素或免疫抑制剂,处于免疫抑制状态。免疫功能受损患者感染发生率高,病原体多而复杂,诊断更加困难。因此病原学的精准诊断对肾脏疾病免疫抑制伴感染患者精准诊疗的价值毋庸置疑。但传统的病原学诊断高度依赖于临床医师的经验,根据患者的临床表现做出病原体的鉴别诊断,针对可疑的病原体进行检测,存在检测周期长、阳性率低、受抗生素使用,特殊病原体难于检测等因素影响,已经不能满足当前临床需要。 宏基因组二代测序(mNGS)技术可以快速、无偏倚地同时检测多种病原体,已广泛地应用于临床感染性疾病病原检测,成为助力疑难、危重感染诊断的新方法。

什么是mNGS

mNGS通过对临床样本的DNA或RNA进行鸟枪(shotgun)法测序。二代测序(NGS)是一种可同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。mNGS指对临床标本中的全部生物(人、微生物)基因组进行分析,能够无偏倚、无偏差地检测多种病原微生物(病毒、细菌、真菌及寄生虫)的一项技术。

宏基因技术是把微生物的核酸打断成核酸片段后进行测序,微生物的序列数就是检测到多少个核酸片段属于该微生物,因此序列数往往与该病原体的载量正相关。相对丰度是指该病原体在检测到的同类微生物中的序列占比,由于细菌、真菌、病毒和寄生虫的微生态特征、临床意义不同,它们是独立计算相对丰度的,如某个细菌的相对丰度是该细菌在该样本所有检出细菌中所占的百分比。因此相对丰度越高,表示该病原体在标本中的占比越高,但不同大类间的微生物相对丰度无法互相比较。基因组覆盖度是指该微生物核酸序列覆盖到该微生物整个基因序列的比值,基因组覆盖度与序列数有关,序列数越多,核酸越高,表示该病原体在标本中真实存在的可性能越高。相对丰度越高,可信度越高;序列数越多,检测结果越准确。

mNGS的优势

诊断时间大大缩短免疫抑制患者感染通常病情进展快,机会性感染多,而常规的微生物培养需要数日才有结果,从而延误诊断。而mNGS最快的24 h内即可出结果,为精准诊断与治疗赢得了时间。

诊断的阳性率提高因为传统常规微生物检测比较容易受到微生物数量的影响,如抗菌素使用后,细菌的数量迅速下降或者死亡。而对于NGS来说,只要有病原体的基因存在,不管是否活菌,都能够检测到,大大提高了诊断阳性率。

发现难以培养的病原微生物mNGS可以检测到其他传统手段无法检出的病原体。常见如肺孢子菌、支原体、衣原体、军团菌等。肺孢子菌肺炎(PCP)在免疫抑制肾脏病患者合并重症肺部感染中并不少见,可导致急性呼吸窘迫综合征,及时诊断和治疗是降低病死率的关键。但PCP早期病原学诊断困难,病原检出率低,容易延误诊治。我们通过mNGS检测患者外周血中的病原序列,证实了mNGS可用于PCP的诊断,具有较高的敏感度(94.59%)和特异度(100%),具有无创、简便、快速的优点,大大提高了治疗的成功率。

发现继往认为少见的病原体感染mNGS从基因层面可以发现更多的继往认为少见的感染。我们近来的临床工作中先后应用mNGS检测技术成功诊断马尔尼菲篮状菌合并非结核分枝杆菌、恙虫病立克次体、鹦鹉热衣原体及豚鼠耳炎诺卡氏菌等病原体感染,为临床及时调整治疗提供了极大帮助。

发现混合感染免疫力功能低下患者易发生混合感染,而传统检测方法很难不出现遗漏。与传统方法相比,病原mNGS 检测由于其独特的机制,具有更广的微生物检出谱。我们最近的工作也发现CKD合并肺孢子菌患者中巨细胞病毒(CMV)血症阳性率高达57.7%,其免疫缺陷程度更重,预后较无CMV血症者更差。因此,mNGS其对病原微生物几乎达到“一网打尽”效果,能同时一次性敏感检出不同类病原体,尤其在细菌感染合并真菌、病毒、支原体、衣原体或原虫等感染时更具显著意义。

如何解读mNGS报告

mNGS最大优势在于快速精准、高通量检测,为早期抗感染治疗提供证据支持,正确的解读同样是保证mNGS优势的关键。由于mNGS操作流程复杂,各个环节均易引入污染,干扰检测结果,且检出的病原体无法具体确定是定植菌、背景菌还是致病菌,因此对于测序结果为阳性的报告应根据患者临床特点、免疫功能状态,及辅助检查结果系统分析、解读和验证。

阳性结果固然有助于明确感染病原体,阴性结果亦可用于排除感染性疾病可能。对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物,如分枝杆菌属、诺卡菌属、真菌(主要包括曲霉菌、毛霉菌、隐球菌属与双相真菌)等,即使在检测报告中读数较低,也要考虑其为致病微生物的可能,并采用其他方法验证。

mNGS作为一种新的检测手段,拓宽了微生物检查的途径和范围、弥补了常规检测手段的一些缺憾。mNGS对肾脏病免疫功能受损不明原因感染,尤其是条件致病病原学诊断具有更高敏感性,有助于更早识别病原体和指导治疗用药。