病原体宏基因检测在肾脏疾病感染患者中的应用

陈江华 王仁定

1998年提出的宏基因组概念最初指土壤标本中所有微生物基因组信息的总和,包括无法培养的基因组信息。后来宏基因组概念被应用于临床标本中的生物遗传信息特征。宏基因组二代测序(mNGS)主要通过以二代测序为代表的高通量测序技术,对临床标本进行宏基因组学分析,从而获取病原体的分类、血清型、耐药性以及毒力等一系列生物学信息。

mNGS是一种直接从患者标本中检测样本中的所有核酸, 并按等位扩增和测序,允许对所有微生物组(即细菌、病毒、寄生虫和真菌)、耐药性标记物、毒力因子、甚至与不同疾病状态相关的宿主生物标志物进行鉴定。这提供了直接从患者标本进行无假设诊断的优势。mNGS已被证明是检测多个部位感染的成功诊断工具,包括中枢神经系统、血流、呼吸道、胃肠道、人工关节、泌尿道和眼部。鉴定出的各种病原体包括细菌、分枝杆菌、RNA和DNA病毒、酵母和霉菌、寄生虫。mNGS在检测新的、例罕见和非典型病因或接受过治疗的患者中尤其成功,因此mNGS 也作为人群中发现潜在危险和(或)突发病毒的理想工具。目前在肾脏疾病领域主要集中在肾移植供受体围手术期精准化治疗、明确免疫功能低下肺部感染病原菌以及部分泌尿系统感染的检测。

mNGS助力肾移植供受体围手术期精准化治疗

目前我国肾移植的供体主要来源亲属活体捐献和公民死亡后捐献,特别是公民死亡后捐献的供体,由于重症捐献者都在监护室救治,需要气管插管,可能使用大量广谱抗生素等继发病毒、耐药菌、真菌等病原菌感染。对供体的相关体液包括装载供体器官的保存液进行mNGS检测,可以在器官植入受体前或术后尽早获得相关病原菌和病原菌耐药信息,对决定器官的使用与否,以及器官移植后的精准抗感染治疗具有重要的意义。

对于器官移植受者,由于术后早期需要使用大剂量免疫抑制剂,对T细胞和(或)B细胞进行抑制和清除,感染表现常不典型和被掩盖,尽管可以采取相关体液培养,但由于术后抗生素的使用和培养的时效性问题,使培养结果的阳性率较低和及时性较差。对受体的相关体液包括创口引流液进行mNGS检测, 可以尽早发现感染病原菌,尽量避免“大包围”抗生素使用;同时对于无感染依据的受体,可尽早降低抗生素使用级别,实现围手术期的精准抗感染治疗。我们对270例公民死亡后捐献供肾的术后引流液采用 mNGS检测监控, 实现了无供体来源的真菌、耐药菌导致的受体死亡和感染性血管破裂等严重并发症,同时明显降低了抗生素使用级别和疗程。

mNGS在明确免疫功能低下肺部疾病中扮演重要角色

免疫性肾脏疾病患者常长期接受免疫抑制治疗,易造成机体免疫功能低下。免疫功能低下患者的传染病及感染诊断具有独特的挑战性。这一人群中的患者通常出现不寻常病原体感染,具有常见病原体的非典型表现,并且更容易合并感染。对免疫功能低下患者的感染性疾病评估可能会耗费临床医生的时间和资源,可能需要大量的微生物学诊断测试来确定致病病原体或排除感染。

耶氏卡氏肺囊虫感染在免疫低下没有采用有效预防的患者中,常导致严重肺部感染甚至患者死亡。既往对于此类的有效诊断是肺泡灌洗液中通过六胺银染色发现囊虫或通过吉姆萨染色确诊卡氏肺囊虫滋养体,特别是后者的判定需要经验丰富的检验者才能确诊。相关研究包括我们的研究提示采用mNGS对肺泡灌洗液进行检测可以明确是否存在耶氏卡氏肺囊虫感染;肺泡灌洗的实现需要病人能够耐受气管镜检查或已经在呼吸机呼吸支持的患者,对于没有呼吸机支持而不能耐受肺泡灌洗的肺部感染患者,肺泡灌洗液的mNGS则无法采用;我们的临床实践提示采用外周血mNGS同样可以明确诊断耶氏卡氏肺囊虫感染。mNGS可以提前明确卡式肺囊虫感染,为后续治疗提供有力病源学依据。

免疫低下患者常存在特殊病毒感染和真菌感染, 如巨细胞病毒感染可以导致严重的肺部感染甚至呼吸衰竭。既往的研究提示器官移植后曲霉菌感染75%的病例是临床诊断, 仅有25%是病原菌确诊的。另外,特别是预后极差的毛霉菌感染对临床的诊治带来了极大的挑战。mNGS可以及时发现病毒感染,并能明确是否合并其他病原菌感染和感染类型,包括少见的病原菌感染(如马尔尼菲青霉菌),尽早明确病原菌可以为治疗赢得时间,挽救患者生命。 mNGS在免疫低下患者特别是肺部感染的病原诊断中扮演相当重要的角色。

mNGS检测在泌尿系统感染的意义

尿液培养是诊断尿路感染的金标准,目前有mNGS检测应用于泌尿系感染的研究,尤其是在某些特殊情况下具有更多的优势。但对于一般的尿路感染,最常见的细菌为大肠杆菌,普通的尿液培养可以有效明确病原菌同时可以明确病原菌的药敏,mNGS由于较高医疗费用及无法给出细菌的药敏,在普通泌尿系感染中并不具有优势。对于非免疫低下的病患,泌尿系真菌感染比较少见,但对于免疫低下患者,尿液真菌培养可以获得临床效果,mNGS可以作为一项替代的检测方法,能比较快速地明确真菌感染类型。泌尿系感染中病毒感染少见,常规的培养无法明确,mNGS优势明显,可以明确病毒类型,特别是对于肾移植术后多瘤病毒感染患者, 我们的研究提示采用目标区域捕获二代测序方法对鉴别多留病毒肾病和急性T细胞介导的小管间质性排斥具有一定的意义;对于特殊的尿路感染如结核杆菌,由于培养耗时,mNGS具有较好的时效性。另外如在免疫力低下的情况下,可能出现少见的马尔尼菲青霉菌感染,此类真菌容易被检验科医师所忽略,mNGS具有确诊优势。临床实践中,肾活检病理中存在间质中性粒细胞浸润和(或)肾小管中有白细胞管型的疑似感染性相关间质性肾炎,在无法明确病原菌感染时,mNGS可能通过对尿液标本和肾脏组织标本进行检测,可以发现感染病原微生物。因此,在尿路感染中,mNGS在病毒性尿路感染、真菌性尿路感染以及特殊尿路感染如结核、马尔尼菲青霉菌等感染的鉴别诊断中具有优势。

mNGS在肾脏疾病领域特别是免疫低下患者中具有较好的应用前景,该检测对临床样本直接进行检测,可以发现少见病、不典型及新型病原学。对于无法培养的病毒感染、已暴露在抗生素下以及生长缓慢的病原菌如真菌等具有辅助诊断作用,能够提供基于精确医学的诊断方法。但临床医师在使用和解读MNGS时必须了解这些方法的差异和局限性。如mNGS程序中是否包含基于RNA的方法,是否对胞内菌采用了破壁处理,检测结果是否反映临床感染还是定植,是否存在污染等问题进行综合判断。