病原体宏基因检测在慢性肾脏病合并感染患者中的应用

任红旗

二代测序(NGS),亦称为高通量或大规模并行测序。与传统的测序方法相比,这些非基于Sanger的新技术具有通量高,测序速度快,运行成本低和准确性高等优势。其核心是边合成边测序,其特点是能一次运行几十万到几百万条DNA分子的序列测定,极大地降低了测序成本、提高了测序效率。在微生物检测中,NGS可用于宏基因组、全基因组、转录组、目标基因等测序,是目前病原微生物研究领域应用最为广泛的测序手段。

宏基因组二代测序(mNGS)技术指采用NGS技术对特定标本中所有核酸序列进行测序。mNGS是一种新的诊断技术,可以快速、准确、无偏倚地检测受者样本中的所有病原体,对复杂和罕见病原体的鉴定有很大帮助。随着技术的不断进步,mNGS在临床上逐渐普及,尤其适用于器官移植后、免疫缺陷和长期使用免疫抑制剂患者的严重感染。

慢性肾脏病(CKD)合并感染

CKD感染的发生率及可能机制感染是CKD患者常见并发症,不仅是引起疾病进展的重要原因,也是CKD患者住院和死亡的第二位原因,占CKD患者全因死亡的35%。根据美国肾脏数据系统,从2001～2010年,血液透析第一年的肺炎入院率平均为26.6次/1 000患者·年。血液透析患者因脓毒症导致的死亡风险比普通人群高约250倍。

CKD患者先天和适应性免疫系统的正常反应受损,容易导致感染。与普通人群相比,肾功能不全患者会出现明显的免疫失调,其特点是慢性免疫激活和慢性免疫抑制并存。尿毒症可能直接或间接影响肠道屏障和肠道微生物的组成,细菌及其产物通过肠道屏障移位,激活先天免疫;此外,氧化应激、炎症和代谢失调进一步引起患者免疫功能障碍,从而导致疫苗接种反应差,感染和恶性肿瘤发病率高。尿毒症患者免疫功能减退的主要因素包括尿毒症毒素、营养不良、慢性炎症、维生素D-甲状旁腺激素轴的改变及透析相关因素。

CKD感染的病原学特点CKD患者合并感染的病原体除常见的细菌、病毒、支原体及衣原体外,还有一些特殊的病原体。

肺孢子菌肺炎(PCP) 肺孢子菌是呼吸道常见定植微生物,经空气途径传播,可发生人与人传播。在非人类免疫缺陷病毒(HIV)感染患者中,免疫抑制疗法特别是激素联合细胞毒药物是发生PCP的非常重要的危险因素,此外,肾功能减退也与PCP发生密切相关,推测这可能是由于肾小球滤过率(GFR)降低,循环中免疫抑制剂蓄积,导致机体免疫功能进一步减退。

巨细胞病毒(CMV)感染 CMV是免疫功能受损患者最常见的病毒感染,发生率与免疫抑制治疗有关,因此在肾移植患者中更受关注。

奴卡菌感染 奴卡菌属革兰阳性放线菌,是一种条件致病菌。细胞介导免疫对于抑制奴卡菌感染至关重要。大剂量激素、免疫抑制剂使用及肾移植等是CKD患者合并奴卡菌感染的危险因素。

结核分枝杆菌(MTB)感染 CKD患者MTB感染有以下特点:潜伏感染,临床表现不典型、肺外结核的发病率高,结核中毒症状常常被CKD患者非特异症状如疲劳、营养不良所掩盖,病死率高等。

mNGS在CKD感染中的应用

重症感染CKD患者临床常见的重症感染有脓毒症、中枢神经系统感染、重症肺炎等。Jiang等报道373例CKD 5期患者中,有333例发生感染,其中,普通感染307例(82.3%);重症感染26例(7.0%)。26例重症感染患者中,血液透析患者占92.3%,且呼吸道感染最常见(占66.8%)。Peng等报道112例住院治疗的狼疮性肾炎患者中28例(25%)合并重症肺炎,且死亡率较高(53.6%)。陈乐波等报道187例肾病综合征合并重度感染的患者,包括危重症感染53例(28.3%)和重症感染134例(71.7%)。感染类型以肺部感染最多见,共102例(54.55%),其次是皮肤软组织感染55例(29.41%)。危重症感染以肺孢子菌、侵袭性曲霉、鲍曼不动杆菌等机会性感染为主,重症感染患者病原体多数不明。此外,CKD 5D期患者中枢神经系统感染比较常见,Hsu等报道与对照组比较,透析患者发生中枢神经系统感染的风险增加了3.46倍,死亡风险增加了5.99倍。

对于重症感染的诊断,mNGS 具有较高的临床应用价值,能够快速、精准地找到病原体。Chen等对20例重症肺炎患者行mNGS检测,17例(85%)检出病原体,其中10例为细菌感染,5例为病毒感染,2例为真菌感染,而传统方法病原学检出率仅为50%。Zhang 等在135例细菌性脑膜炎患者中,应用mNGS 诊断肺炎链球菌脑膜炎的敏感性和特异性分别为73.1% 和88.1%。

复发性尿路感染尿路感染是CKD患者常见的并发症,可加速CKD进展,增加患者病死率。常见因素包括激素和免疫抑制剂使用、泌尿系结石、多囊肾、糖尿病、神经源性膀胱及导尿管的使用等。与非糖尿病患者相比,糖尿病患者发生尿感的相对危险性明显增加,急性肾盂肾炎发生率增加10倍。糖尿病患者不仅尿路感染发生率高,且因尿路感染产生的并发症(如气肿性膀胱炎、脓肿形成、肾乳头坏死等)发生率也增高,危害极大。

复杂性尿路感染,传统的尿培养及血培养,病原学检出率比较低。传统尿培养和血清学检测致病微生物阴性的样本,采用mNGS,可以明显提高阳性检出率。Ishihara等研究10例急性复杂性尿路感染患者,尽管接受治疗仍有急性膀胱炎症状,但尿培养结果阴性,采用mNGS后病原学的阳性检出率明显提高。McDonald等报道mNGS有助于提高神经源性膀胱合并无症状尿路感染患者病原学的检出率。疑似非典型细菌或厌氧菌感染的复发性尿路感染的患者,细菌载量低或传统方法无法诊断的耐药性感染,mNGS明显提高病原学检测阳性率。 此外,Liu等报道1例CKD合并尿路感染患者,病原学不明,经用mNGS检测成功诊断恙虫导致的尿路感染。

免疫缺陷患者感染的诊断CKD患者由于长期使用糖皮质激素,免疫抑制剂及肾功能损害,常易发生免疫功能缺陷。体内中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞抗菌能力下降,树突状细胞对T细胞依赖性免疫应答减少,效应和调节T细胞功能下降,B细胞凋亡增加等,易发生感染,包括一些特殊且少见的病原体,如肺孢子菌、奴卡菌、鹦鹉热衣原体及结核分支杆菌。然而,由于这些病原学常规检测阳性率较低,临床上易误诊或漏诊。而mNGS检测显示出良好的诊断潜力,不受免疫抑制程度的影响,并且能指导抗感染药物治疗。

李世军等观察CKD接受免疫抑制治疗后合并弥漫性肺部感染、临床拟诊为PJP患者37例,采用mNGS检测外周血样本37份,其中35份检出耶氏肺孢子菌序列,敏感度94.59%,特异度100%;31例患者为混合型感染,27例检出病毒序列(19例为巨细胞病毒),8例合并细菌感染。因而,mNGS较PCP 的其他病原学诊断方法更具优势,对免疫抑制合并肺部感染患者的诊断有重要的指导意义。Zhang等用mNGS检测肾移植合并疑似PCP肺部感染的患者,13/14例患者外周血PCP阳性,其中11例PJP阳性患者经PCR证实。

小结:感染是CKD患者常见并发症,及时诊断,及时救治,可降低患者的死亡率。mNGS能无偏倚性检测各种病原体,弥补了传统病原学检测方法的不足,在CKD合并感染性疾病的诊断中显示出巨大的临床应用价值。然而,mNGS 应用于临床检测,需注意缺乏标准化的数据处理和数据分析,无法直接检测RNA病毒,结核分枝杆菌、军团菌等检测率低,假阳性及假阴性结果等问题。