胆道闭锁肝脏不同病理分期的免疫微环境研究①

张昊东 康 权 （重庆医科大学附属儿童医院渝中院区普外科，国家儿童健康与疾病临床研究中心，儿童发育与疾病教育部重点实验室，重庆市干细胞治疗工程技术研究中心，重庆 400014）

胆道闭锁（biliary atresia，BA）是一种严重的新生儿疾病，表现为进行性炎症和纤维化阻塞肝内和肝外胆管，如不经治疗大部分患儿2 岁内会因进行性纤维化肝衰竭而死亡，进行葛西手术后约一半患儿仍伴有进行性肝纤维化，但经过肝移植手术后大部分患儿可存活至成年［1-2］。

基于目前研究，无论是哪种因素诱发的BA，均会激活BA 先天性及适应性免疫应答，且均支持炎症反应促进胆管损伤［3］。已有多个研究将病理组织学和临床信息及预后联系起来，提示儿童预后不良或与纤维化有关［4-5］。

尽管免疫细胞及免疫相关细胞因子或趋化因子、细胞因子受体在BA 发生发展中发挥重要作用，如树突状细胞、NK 细胞以及CD4/CD8 在诊断时位于婴儿肝脏中，直接参与上皮破坏和促进适应性炎症反应发展，并与过度表达的活化标志物有关［5］。体外 T 细胞研究表明，BA 患者 CD4+和 CD8+T 细胞具有寡克隆扩增功能［6］。但尚无系统研究分析BA 不同病理分期的免疫细胞浸润情况，以及免疫相关基因和分子通路表达差异。因此，本研究拟评估BA不同病理分期中的免疫相关基因，以及浸润免疫细胞和途径激活水平差异。

1 材料与方法

1.1 材料 从NCBI基因表达综合数据库（GEO）下载GSE15235 芯片数据集。GSE15235 表达数据以GPL570 相应探针注释。该数据集包含47 个有病理临床信息的BA 样本，选取其中组织学评分≥2 分的14 个主要为炎症（n=9）和纤维化（n=5）的样本进行分析。从 ImmPort（https：//www. immport. org/home）数据库下载得到2 498个免疫相关基因。

1.2 方法

1.2.1 数据预处理及基因差异分析 采用R 软件包limma 对芯片数据进行标准化处理，差异基因的筛选截断值设为|log2FC|＞1，P＜0.05，并与 ImmPort下载的免疫相关基因取交集得到免疫相关差异基因（趋化因子、细胞因子及细胞因子受体等）。

1.2.2 免疫细胞评估 采用ImmuCellAI 在线网站分析芯片数据，包括18 个T-细胞亚群的24 种免疫细胞丰度。

1.2.3 基因富集分析 采用clusterProfiler 软件包进行富集分析，富集分析基于GO和KEGG数据库注释基因表达数据，以P＜0.05为显著富集的临界值。

1.3 统计学分析 采用Mann-WhitneyU检验比较不同组免疫细胞丰度。P＜0.05 为差异具有统计学意义。所有统计检验均为双侧检验，所有统计测试和可视化分析均采用R软件（3.6.3版本）完成。

2 结果

2.1 免疫相关基因表达 通过差异分析得到91个差异基因，其中40个炎症组上调，51个纤维组上调，并将包含于ImmPort 数据库中的免疫相关基因用热图表示（图1）。包含13 个免疫相关基因MMP9、IL1RL1、RASGRP1、MPO、CCL20、SEMA6A、CXCL11、PTX3、HSPA6、CTSG、RNASE3、GREM1 和 CD8A，表达情况见表1。KEGG 富集分析显示免疫相关差异基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用通路（图2A），GO 富集分析显示免疫相关差异基因主要参与的分子生物学过程包括抗菌体液反应、对真菌、细胞外基质的组织、对细菌的防御反应、细胞外结构组织中性粒细胞介导的免疫应答、中性粒细胞激活、中性粒细胞激活参与免疫应答及嗜中性粒细胞脱颗粒过程等（图2B）。

图2 免疫相关差异基因的KEGG和GO富集分析Fig.2 KEGG and GO enrichment analysis of immune-related differentially expressed genes

表1 免疫相关差异表达基因Tab.1 Immune-related differentially expressed genes

图1 BA炎症组和纤维化组差异表达基因Fig.1 Differentially expressed genes between inflammatory group and fibrotic group in BA

2.2 免疫细胞表达 通过ImmuCellAI 在线工具评估GSE15235数据集的14个包含病理分级的肝脏样本（5 个主要表现为炎症和9 个主要表现为纤维化）的24 种免疫细胞丰度（图3A）。肝纤维化组中显示nTreg 及iTreg 呈高表达，NKT 细胞及中性粒细胞呈低表达（图3B）。

图3 BA中24种免疫细胞丰度Fig.3 Abundance of 24 types of immune cells in BA

2.3 基因集富集分析 根据BA 不同分期组基因表达GSEA 结果，发现通过KEGG 注释的通路中炎症组，如ErbB 信号途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用及代谢相关途径被显著激活。纤维化组主要激活的途径有ABC转运蛋白、维生素A新陈代谢、药物代谢-细胞色素P450、其他类型O-聚糖生物合成及EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药等途径（图4A）。GO数据库注释的分子生物学过程显示炎症组富集的主要为白细胞聚集、白细胞迁移参与炎症反应及黏膜先天免疫应答过程等，而纤维化组主要富集于T细胞受体复合物、T 细胞趋化调节、调控趋化因子介导的信号通路、干扰素分泌调节、赋予抗拉强度的细胞外基质结构成分及胶原蛋白-激活信号等过程（图4B）。

图4 基因集富集分析Fig.4 Gene sets enrichment analysis

3 讨论

本研究旨在探讨BA 肝脏不同病理分期的免疫微环境差异。通过差异分析得到13个免疫相关差异基因，MMP9、IL1RL1、MPO、CCL20、PTX3、HSPA6、CTSG和RNASE3主要在炎症组中高表达，RASGRP1、SEMA6A、CXCL11、GREM1 和 CD8A 主要在纤维化组中高表达。KEGG 富集分析显示免疫相关差异基因主要富集于细胞因子受体相互作用通路，GO 富集分析显示免疫相关差异基因主要参与的分子生物学过程包括抗菌体液反应、细胞外基质的组织、对细菌的防御反应、细胞外结构组织中性粒细胞介导的免疫应答、中性粒细胞激活、中性粒细胞激活参与免疫反应及嗜中性粒细胞脱颗粒过程。Immu-CellAI 分析提示肝纤维化组中nTreg 及iTreg 呈高表达，NKT 细胞及中性粒细胞在炎症组中高表达。GSEA 分析显示炎症组主要激活代谢及细胞内信号传导类分子途径等，纤维化组主要激活细胞基质及T细胞介导的适应性免疫应答相关分子途径。

免疫相关细胞因子、趋化因子和受体与促炎纤维化信号的触发和放大密切相关，如小鼠BA 模型中IL-1R1或NLRP3靶向损失，可保护新生小鼠免受RRV 诱导的胆管阻塞［7］；基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族广泛参与炎症过程，MMP9 可防止LPS 诱导的成骨细胞炎症及可限制结肠炎相关癌症中的活性氧积累和DNA损伤［8-9］；髓过氧化物酶是白细胞分泌的一种高度氧化酶，与人类和实验性非酒精性脂肪性肝炎有关，且在机制上还与房颤和纤维化有关［10-12］；一项研究发现随着肝病患者肝纤维化程度增加，CXCL11 水平升高［13］；还有研究表明CXCL11 通过改变异常的血管重塑抑制肺纤维化［14］。表明免疫相关基因在炎症期或纤维化期发挥重要作用。

BA 患儿诊断时肝脏有多种免疫细胞（CD4+细胞、CD8+T 细胞、NK 细胞及 DC 细胞）和促炎细胞因子（细胞因子、趋化因子和白细胞介素等）浸润。Treg 作为一种调剂免疫耐受的细胞，在调控免疫细胞，如CD8 细胞、NK 细胞及Th1 细胞功能上发挥重要作用，其数量或功能缺陷会导致T 细胞介导自身免疫应答加重胆管损伤［15-20］。本研究发现nTreg 和iTreg 在BA 肝纤维组中表达高于炎症组，与既往实验性BA 研究结论一致。RRV 感染后小鼠BA 模型的细胞行为表明，当小鼠在7 d 的生命中胆管损伤时，肝Treg 迅速增加10 倍，但在第1 天注射时未观察到这种增加［20］。可能与炎症早期Treg 数量和功能不足导致无法控制炎症破坏胆管有关。NKT 细胞在炎症组中表达高于纤维化组，炎症早期NKT 细胞作为先天性免疫应答细胞迅速参与炎症反应，纤维化期Treg 增加受抑制后活性降低［20］。肝脏炎症典型特征为重新募集主要由单核细胞、早期活化的促炎巨噬细胞、嗜中性粒细胞和NK 细胞组成的炎症细胞库，以上细胞损害肝血管结构和功能，这些先天性免疫细胞首先被激活募集至肝脏损伤胆管细胞［21］。也有研究显示嗜中性粒细胞可促进肝脏炎症和纤维化自发消退［22］。目前针对以上免疫细胞在BA中的具体作用机制尚不清楚。

本研究描绘了BA 发展免疫微环境的变化，但具有一定局限性，首先，本研究仅揭示了不同病理分期BA 肝脏免疫微环境，无法在单细胞水平反映类型和状态，更为先进的单细胞RNA 测序可揭示各独立细胞的特异性。其次，本研究包括BA 肝脏样本数较少，本身BA 肝脏炎症和纤维化病理分期界限较为主观，因此在评估BA 肝脏进展中的免疫微环境方面可能存在偏差。最后，需进行动物和实验室实验进一步阐明免疫微环境在BA 发病及发展机制中的作用。

总之，本研究评估了BA 不同病理期浸润的免疫相关基因、免疫细胞及分子途径激活水平，有助于阐明BA发病机制，为BA治疗提供新的方向。