EGCG上调Nrf2表达促进糖尿病小鼠创伤皮肤愈合①

李 迎 宋 宇 王 旭 张吉林 宋玉国 （北华大学附属医院，吉林 132011）

皮肤是机体表皮系统中的最大器官，具有保护组织、维持体内平衡、抵抗病原微生物感染和环境因子侵入等多种重要功能。伤口愈合迁延或速度减慢是皮肤创伤研究的重点。全身性疾病、氧化应激、缺血、免疫抑制、伤口局部促炎或抗炎症细胞因子失衡等是伤口愈合慢性化的主要原因［1］。糖尿病伤口愈合障碍（diabetic non-healing wound，DNHW）是糖尿病最常见的危害性较大的并发症，活性生物材料和水凝胶敷料的应用以及高压氧等措施虽然为其治疗展示了一定程度的疗效，但最终效果仍不能令人满意。在伤口的愈合阶段，通过对一些转录因子激活路径的检测分析有助于理解慢性伤口愈合的分子机制［2］。核因子相关因子2［nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2，Nrf2］是一种关键转录因子，具有调控各种细胞抗氧化基因表达和抑制炎症因子的功能［3］。因此，在研究DNHW 新的治疗靶点上，研究者把焦点集中在寻找天然、高效的Nrf2 激活剂上。Nrf2-Keap1 通路是通过上调Nrf2 表达、降低氧化应激和降低炎症细胞因子的主要通路［4］。一些植物含有的化合物如芹菜素、虾青素、姜黄素、富马酸二甲酯和表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG）等均可通过 Nrf2-Keap1 通路调控氧化应激水平和抑制炎症细胞因子表达［5-9］。本文在前期研究工作的基础上［10-11］，进一步从整体水平上研究DNHW 小鼠应用EGCG 治疗后，是否能上调创口皮肤组织Nrf2 的表达，通过Nrf2-Keap1 通路上相关指标的检测探讨EGCG 上调Nrf2表达治疗慢性皮肤损伤的作用机制，为治疗DNHW 寻找和证实新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级雄性 ICR 小鼠，5 周龄，体质量（20.05±1.50）g，来源于中国食品药品检定研究院，许可证号：SCXK（京）2017-0005，相关微生物检测合格，健康状态良好，饲养于吉林医药学院实验动物室，实验环境符合要求。

1.1.2 主要试剂和仪器 链脲佐霉素（STZ）、EGCG 购于Sigma 公司；动物组织总RNA 提取试剂盒、cDNA 合成试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；PCR 扩增引物由生工（上海）科技有限公司合成；免疫组化抗体购于英国Abcam公司；荧光定量PCR扩增仪（德国罗氏480型）；多功能细胞成像仪（Bio-Tek Cytation5，美国）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠糖尿病模型和伤口愈合障碍模型的建立［11］小鼠腹腔注射 STZ（5 µg/µl），200 µl/d，连续5 d，空腹血糖≥13 mmol/L 者，视为小鼠糖尿病模型构建成功。在小鼠左后背靠近尾部，人工制造直径约10 mm的皮肤创口，每只小鼠分笼饲养，隔日用标尺测量创口直径，拍照记录；糖尿病组创口愈合剩余面积明显高于正常对照组，证明糖尿病伤口愈合障碍模型建立成功。尾静脉取血，应用微量全血试纸法直接检测空腹血糖，以STZ注射结束后2周为节点，判断糖尿病建模是否成功。

1.2.2 EGCG 对小鼠糖尿病伤口愈合障碍的治疗 正常对照小鼠40只，随机分为正常对照（Control）组和正常对照+EGCG（Control+EGCG）组，20 只/组；糖尿病模型小鼠40 只，随机分为糖尿病（DM）组和糖尿病+EGCG（DM+EGCG）组，20 只/组。EGCG 采用二甲基亚砜（DMSO）配制成 5 µg/µl 制剂，作为Control+EGCG 组和DM+EGCG 组的治疗药物，每天在创口处给药10 µl；Control 组和DM 组每天在创口处给予 DMSO 10 µl；连续给药 10 d，隔日观察记录伤口愈合情况，最后统计各组伤口情况。

1.2.3 皮肤样品采集方法 上述实验结束后，采用10%水合氯醛按小鼠体质量以40µl/g腹腔注射，做安乐死处理。小鼠死亡后，快速采集创口处皮肤组织。其中，准确称取皮肤组织5 mg，立即加入300µl 裂解液中用于RNA 提取；其余皮肤组织浸泡于甲醛固定液中，固定后石蜡包埋备用于免疫组化检测分析。

1.2.4 实时荧光定量PCR 检测Nrf2 通路相关的氧化应激及炎症指标mRNA 表达 将裂解液浸泡的皮肤组织用电动匀浆机打碎制成匀浆。按照试剂盒说明书操作提取总 RNA。以Oligo-（dT）15 为引物，以上述提取的RNA为模板合成cDNA。以cDNA为模板，分别加入表1 中的引物和U6 引物，进行荧光定量PCR 实验，检测mRNA 表达量。在PCR 仪上读取每份样本的Ct 值，以U6 为内参照，计算样本中mRNA 的相对表达量。计算公式：RQ=2-ΔCt，其中ΔCt=CtmRNA-CtU6。所得RQ 值取对数后进行统计学分析。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.5 免疫组化技术检测Nrf2 通路相关的氧化应激及炎症指标 新鲜组织固定于10%甲醛24 h以上。依次进行梯度乙醇脱水。将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。于切片机切厚度为5µm的切片，放于漂片机中展开，再将切片捞起置于载玻片上，编号，60 ℃烘烤5 h。做免疫组化实验时，经脱蜡与水化、细胞通透与封闭、抗原修复与血清封闭等方法处理后依次，依次用一抗、二抗标记，最后显色、复染和封片。多功能细胞成像仪拍照记录。利用Image-Pro-Plus 6.0 软件将所有检测指标的表达水平量化为光密度值。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0软件对所得结果进行分析，各组间的参数比较采用两样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠糖尿病模型和伤口愈合障碍模型的建模结果及EGCG 治疗效果 小鼠皮肤造口后，连续观察10 d，各组拍照记录如图1 所示。通过对糖尿病组和正常对照组创口愈合剩余面积进行统计学分析，结果证实，糖尿病组创口愈合剩余面积明显高于正常对照组（P＜0.01），证明糖尿病伤口愈合障碍建模成功；在糖尿病小鼠中，EGCG 药物治疗组的创口愈合剩余面积明显低于非治疗组（P＜0.01），提示EGCG对糖尿病伤口愈合障碍有治疗作用，见表2。

表2 各组创口愈合剩余面积统计分析（，mm2）Tab.2 Statistical analysis of residual area of wound healing in each group（，mm2）

表2 各组创口愈合剩余面积统计分析（，mm2）Tab.2 Statistical analysis of residual area of wound healing in each group（，mm2）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.01；compared with DM group，2）P＜0.01.

10 d 7.26±1.70 6.78±1.90 17.54±3.131）10.31±2.742）Groups Control Control+EGCG DM DM+EGCG n 20 20 20 20 0 d 99.01±6.10 101.50±7.04 96.92±7.62 98.58±6.84

图1 各组皮肤创口愈合图Fig.1 Skin wound healing map of each group

2.2 各组Nrf2 通路相关的氧化应激指标及相关炎症指标mRNA 表达结果 应用实时荧光定量PCR技 术 检测 Nrf2、HO1、NQO1、ICAM-1、VCAM-1 和TNF-α 等 mRNA 的表达量，统计分析结果见图 2，图中的统计数据为RQ 值的对数。与Control 组相比，DM 组 Nrf2 的 mRNA 表达明显降低（P＜0.01），Control组应用EGCG 治疗后Nrf2的mRNA 表达上调不明显（P＞0.05），而DM 组应用EGCG 治疗后，Nrf2的mRNA表达明显升高（P＜0.01）。与Control组相比，DM组HO1的mRNA表达明显降低（P＜0.01）；与未应用 EGCG 治疗组相比，Control 组和 DM 组应用 EGCG治疗后 HO1 的 mRNA 表达均明显升高（P＜0.01）。DM组NQO1的mRNA表达低于Control组（P＜0.05），Control 组 和 DM 组 应 用 EGCG 治 疗 后 NQO1 的mRNA 表达均明显升高（P＜0.01）。与Control 组相比，DM组ICAM-1的mRNA表达明显升高（P＜0.01），Control 组应用 EGCG 治疗后 ICAM-1 的 mRNA 表达量下降不明显（P＞0.05），而DM 组应用EGCG 治疗后 ICAM-1 的 mRNA 表达明显降低（P＜0.01）。与Control组相比，DM 组 VCAM-1 的mRNA 表达明显升高（P＜0.01），Control 组和 DM 组应用EGCG 治疗后VCAM-1 mRNA 表达均明显降低（P＜0.01）。DM 组TNF-α 明显高于 Control 组（P＜0.01），Control 组应用EGCG 治疗以后 TNF-α 的 mRNA 表达下降不明显（P＞0.05），而 DM 组应用 EGCG 治疗后 ICAM-1 的mRNA表达明显降低（P＜0.01）。

图2 实时荧光定量PCR检测各组mRNA表达Fig.2 mRNA expressions were detected by real-time fluorescence quantitative PCR in each group

2.3 各组Nrf2 通路氧化应激免疫组化结果 应用免疫组化技术检测皮肤组织中Nrf2、HO1、NQO1 蛋白和3-NT的表达情况，形态学检测结果和统计分析结果见图3，图中的统计数据为光密度值。与Control组相比，DM 组Nrf2 蛋白表达明显降低（P＜0.01），Control 组和 DM 组应用 EGCG 治疗后 Nrf2 的蛋白表达均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Control组相比，DM 组HO1 和NQO1 蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05），Control 组和 DM 组应用EGCG 治疗后HO1 和NQO1 蛋白表达量均明显升高（P＜0.01）。与Control 组相比，DM 组3-NT 表达明显升高（P＜0.01）；Control 组应用EGCG 治疗后3-NT 表达有所下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；而DM 组应用EGCG治疗后3-NT表达明显下降（P＜0.01）。

图3 各组 Nrf2、HO1、NQO1 和 3-NT 免疫组化检测结果（免疫组化染色，×200）Fig.3 Immunohistochemical results of Nrf2，HO1，NQO1 and 3-NT in each group（Immunohistochemical staining，×200）

2.4 各组炎症因子指标免疫组化结果 应用免疫组化技术检测皮肤组织中ICAM-1、VCAM-1和TNF-α的表达情况，形态学检测结果和统计分析结果见图4，图中的统计数据为光密度值。与Control 组相比，DM组ICAM-1、VCAM-1和TNF-α蛋白表达明显升高（P＜0.01）；Control 组应用 EGCG 治疗后 ICAM-1、VCAM-1和TNF-α蛋白表达有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；DM 组应用 EGCG 治疗后 ICAM-1、VCAM-1和TNF-α蛋白表达均明显降低（P＜0.01）。

图4 各组ICAM-1、VCAM-1 和TNF-α 免疫组化检测结果（免疫组化染色，×200）Fig.4 Immunohistochemical results of ICAV-1，VCAM-1，and TNF-α in each group（Immunohistochemical staining，×200）

3 讨论

在慢性伤口修复过程中，由于复杂的细胞和分子活动导致伤口愈合延迟，愈合速度缓慢［12］。氧化应激、全身疾病、创伤、免疫抑制、缺血、伤口部位促/抗炎细胞因子、白细胞介素、白三烯和补体因子之间的失衡以及细胞外基质蛋白（ECM）的缺乏是延长慢性伤口愈合过程的主要原因［13］。一些常见的慢性伤口包括糖尿病足溃疡、压疮和静脉溃疡［14］。

糖尿病患者血糖控制不佳，机体处于高血糖状态，末梢神经和外周动脉发生病变，皮肤组织长期处于高氧化应激状态是包括糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcers，DFU）在内的 DNHW 的 主 要原因［15］。DFU 是糖尿病的一种危害性并发症，足部皮肤组织破裂接触外界病原体导致伤口愈合受损。在伤口愈合的不同阶段激活相关的转录因子是DFU 治疗的有效策略［2］。Nrf2 是一种关键的转录因子，具有调节细胞抗氧化基因表达和抑制炎症因子的作用［3］。在基础条件下，Nrf2 与 Keap1 结合并形成Nrf2-Keap1-Cul3-E3 泛素连接酶复合物，应用有效的Nrf2 激活剂后引起Keap1-Cul3-E3 泛素连接酶的构象改变，Nrf2 释放，诱导抗氧化基因的转录，最终减少细胞氧化应激［4］。其下游靶点主要包括NQO1、谷胱甘肽-S 转移酶（GST）、过氧化氢酶（CAT）、HO1等，具有消除有毒化合物、分解过氧化氢和促进血红素分解代谢的功能［16］。另外，高血糖状态下，在氧化应激导致细胞损伤的过程中还可引起炎症因子释放、细胞再生障碍、血流动力学改变，加剧了皮肤组织结构重塑障碍。因此，寻找天然、无毒且高效的Nrf2 激动剂是开发DNHW 治疗药物的有效策略。目前所知，Nrf2 有多种激动剂，其中EGCG 具有天然、无毒、高效等优点。本文在前期研究的基础上，重点研究EGCG 上调Nrf2 表达促进糖尿病小鼠创伤皮肤愈合的作用机制，包括Nrf2 被EGCG 激活后上调抗氧化应激指标和降低炎症指标。研究结果表明，糖尿病组小鼠创伤的皮肤组织中Nrf2、HO1和NQO1 的mRNA 表达量明显低于正常对照组，而ICAM-1、VCAM-1 和 TNF-α 的 mRNA 表达量明显高于正常对照组；免疫组化检测得到了同样的结果，从蛋白表达的层面上做了进一步验证。DNHW 模型构建成功以后，重点研究EGCG 对伤口的治疗，前期研究证明了EGCG 糖尿病小鼠的创口具有明显的治疗作用。在此基础上本文重点研究了EGCG 是否具有上调Nrf2 的作用，以及促进糖尿病小鼠创口愈合的作用机制如何。研究结果证明，无论是从mRNA 表达层面还是从蛋白质表达层面，EGCG 均具有上调Nrf2 的作用，Nrf2 上调后可发挥促进抗氧化应激指标上调和降低炎症指标的作用。综上，EGCG 具有上调Nrf2表达、促进糖尿病小鼠创伤皮肤愈合的作用，是治疗DNHW 的理想药物。但以EGCG 为治疗药物，在剂型、剂量以及毒副作用等方面还需进行更加深入的研究，以期早日实现临床应用。