微流控电阻抗检测及其在颗粒分选中的应用*

郑力升， 王一鸣， 李保庆， 褚家如

(1.中国科学技术大学 精密机械与精密仪器系，安徽 合肥 230027；2.中国科学技术大学 安徽省高等学校精密科学仪器重点实验室，安徽 合肥 230027)

0 引 言

从异质的混合物中按某种性质或类型对目标颗粒或细胞进行分选是许多生物医学领域中的重要步骤[1]。在众多生物医学应用中，例如癌症的早期诊断[2]、细胞分化研究[3]、药物筛选[4]等都需要首先将包括细胞在内的生物颗粒进行分离。因此，将生物颗粒分离成同质种群的技术在近年来得到了深入的研究。

目前,许多颗粒分选方法是用颗粒的生化特性作标记，通过添加外部力场实现颗粒的分离[5,6]。例如，荧光激活细胞分选(FACS)，需要预先对样品进行荧光标记[7]；磁激活细胞分选(MACS)，需要细胞表面表达物以及磁珠表面与目标样品结合的特异性抗体[8]。这两种方法都存在要对目标样品进行复杂且较长时间的预处理、需要经过专业培训的人员和昂贵的设备等局限性。

微流控电阻抗检测技术是微小颗粒检测中非常有前途的方法之一[9,10]，具有无标记、多功能、实时和高通量的特点。当颗粒通过微流体管道中的电极时，就会有电信号的变化，这些电信号可传达有关目标颗粒大小、形态、介电和机械特性等生物物理信息[11]，以及与运动相关的量，例如微通道内的颗粒速度和位置信息等[12]。

将电阻抗检测技术与分选技术结合，可以实现异质性样品的分选，并且无需对目标对象进行标记。例如，Schoendube J等人将电阻抗检测与喷墨打印相结合，成功实现了在液滴中封装单个颗粒或细胞[13]。但是通量很低，每分钟只能封装9个液滴，单颗粒率也只有73 %。De Wagenaar B等人使用电阻抗检测和介电泳技术，从精子细胞中分选出了3 μm磁珠[14]。但分选结果缺乏定量的统计分析，而且其采用的介电极化技术可能会影响细胞某些特性。Zhu Z小组将电阻抗检测与PDMS气动阀相结合实现了不同大小的秀丽隐杆线虫的分离[15]，分选通量约为每分钟30只蠕虫。原因是为了给蠕虫的检测和气动阀的响应提供足够的时滞，检测与分选区域间隔距离很长，同时也会错误地分离一些蠕虫。Choi G等人将表征颗粒变形能力的电阻抗测量与气动控制的流体动力推拉机构结合实现不同变形能力的颗粒的分选[16]，通量高达每分钟600个颗粒，然而分选纯度不高，约为88 %。除了相邻两个太靠近的颗粒可能被错误地分选，另一个重要的原因是因为颗粒到达分选区域的时刻与分选脉冲在时间上不匹配，从而导致有可能被错误分选。综上所述可以看出，要实现高通量的颗粒分选，在检测与分选动作上必须具备有较高的检测通量和快速的分选响应；要实现高精度的分选，提高分选纯度，则需要精确预测颗粒位置，实现精准分选。

本文通过实时获取和分析电阻抗信号得到聚苯乙烯小球的大小和速度信息，并对系统运行过程中各类时间进行了计算，以准确预测颗粒在管道中所处的位置，之后结合压电分选技术[17,18]，实现了大小不同的颗粒的无标记检测与分选。为了证明系统的能力，从10 μm和7 μm的混合聚苯乙烯小球溶液中分选出了10 μm的颗粒，分选的纯度为94.9 %，分选通量为1.6 Hz。本文方法为基于电阻抗检测的无标记细胞分选技术研究提供了新的途径，在单细胞检测与单细胞组学研究中有着广阔的应用前景。

1 系统设计与工作原理

基于电阻抗检测的颗粒分选系统如图1(a)所示。含有颗粒的悬液通过样品入口引入，样品流受到来自侧面入口的两条相等的流的横向约束，并被迫进入管道中心的狭窄流中。这确保了悬浮颗粒能依次穿过位于下游的电极检测和压电分选区域。

颗粒的电阻抗测量是通过三个平行共面电极实现的。随悬液流动的每个颗粒在流经电极时会产生一对正负峰值的组合，不同大小的颗粒产生的峰值幅度是不同的。对测得的信号进行实时的分析，准确预测颗粒在管道中所处的位置，并使用基于阈值的触发信号进行分选。

当颗粒流经分选区域时，颗粒通过压电致动器撞击打印室上的柔性膜产生的局部流进行分选。这种分选方式不需要特定的缓冲溶液，而且压电致动器响应时间很短(160 μs)。如果检测到非目标颗粒，压电致动器保持抬起状态，主通道的液体直通，颗粒被冲入废液通道，如图1(b)左所示。当检测到目标颗粒时，压电致动器下压并挤压柔性膜，其内部液体被喷射到主通道中，使得目标颗粒的流动路径发生变化，并进入下行收集通道，如图1(b)右所示。将分选区域后的通道设计为三个出口的模式，是为了让芯片的结构对称，在形成鞘流和产生分选动作时更有利。

图1 颗粒分选系统的设计与工作原理

2 方法与材料

2.1 微流控芯片的制作与设计

电阻抗分选芯片包含三个部分：转接块、微通道层和电极层，如图2(a)所示。转接块是聚二甲基硅氧烷(poly-dimethyl-siloxane,PDMS)立方体，带有用于连接颗粒悬浮液的孔。微通道层是通过软光刻制造的，具体过程如下：使用负光刻胶(MicroChem SU—82025)在玻璃基板上对20 μm厚的微通道模具进行图案化；将 PDMS 预聚物与固化剂以10︰1的比例混合(Dow Corning SYLGARD184)并倒在光刻胶模具上，PDMS厚度为350 μm，在65 ℃下烘烤2 h固化；固化后，PDMS 微通道层使用手术刀切割并被剥离，并打孔以与转接块连接。电极层是通过Lift-off工艺制备的。首先，在玻璃基板上旋涂正光刻胶S1813并通过光刻对电极进行图案化。然后，通过磁控溅射机沉积10 nm的Cr和75 nm的Au。将覆盖金属的玻璃基板放入丙酮中浸泡3 h实现电极的剥离。电极层和微通道层进行氧等离子体处理后，在显微镜下将微流体管道和电极对准并键合组装。转接块通过氧等离子体处理与微通道层键合。电阻抗芯片制作好后，将其嵌入定制的印刷电路板(printed circuit board,PCB)中，以实现与外围检测设备的稳定电气连接，并减少噪声的干扰。

为了实现颗粒的良好检测与分选，电极的宽度为20 μm，相邻电极之间的间距为30 μm。微流体主管道的宽度为250 μm，分选区域的长度也为250 μm。电极右侧与分选区域之间的距离约为1 500 μm，一方面是为了给电阻抗信号的采集和实时处理提供足够的时间滞后，另一方面是为了减小分选过程中流体偏转对电阻抗信号的扰动，如图2(b)所示。

图2 微流控芯片的制作与设计

2.2 实验装置

将直径为10 μm的聚苯乙烯小球和直径为7 μm的聚苯乙烯小球以1︰1的比例混合，并悬浮于 1×PBS 溶液中来制备颗粒悬浮液，该PBS中含有足够的蔗糖以使悬浮介质的密度与颗粒的密度(1 050 kg/m3)匹配，两种颗粒的浓度都为1×105个/mL。为了防止颗粒聚集，在实验之前对样品进行超声处理。鞘流液为含有染料和足够蔗糖的1×PBS 溶液。用压力控制系统(MFCS-EZ,Fluigent,France)控制微流体装置中鞘流的形成以及样品颗粒的连续泵入。为了实时观测颗粒在管道中的运动状况，将高速相机(2F04，Revealer，中国)与倒置显微镜(MF52，MSHOT，中国)结合实时观测管道中的颗粒。

2.3 电阻抗检测与分析

使用配备跨阻放大器(HF2TA，Zurich Instruments，Switzerland)的锁相放大器(HF2LI，Zurich Instruments，Switzerland)以差分模式记录电阻抗数据。锁相放大器的输出端给中间电极施加频率为1 MHz，幅度为1 V的交流电压信号，跨阻放大器将另外两个电极测得的电流信号转换为电压信号并传输到锁相放大器(增益为1 kΩ)。锁相放大器以100 Hz的低通滤波器带宽和899 Sa/s的采样频率以差分模式记录数据。在颗粒分选实验中，使用MATLAB(MathWorks,USA)中的定制程序实现电阻抗信号的实时记录和处理。

3 结果与讨论

3.1 不同大小颗粒的电阻抗信号获取

本实验中要实现对不同大小的聚苯乙烯小球的分选，首先需要对不同大小的颗粒的电阻抗检测信号进行分析。图3(a),(b)分别为直径为10 μm和直径为7 μm的聚苯乙烯小球的典型电阻抗信号波形图，不同大小的颗粒在流经电极时都会产生一对正负峰值的组合，提取正负峰值的幅度表征颗粒大小，提取正负峰值之间的时间间隔以计算颗粒的速度。

图3(c)显示了直径为10 μm和7 μm的聚苯乙烯小球按数量比1︰1混合时持续测量60 s所获得的电阻抗信号。其中，方点标记的是直径为10 μm的聚苯乙烯小球，圆点标记的是直径为7 μm的聚苯乙烯小球。相同大小的颗粒产生的峰值幅度并不完全相同，这主要是由于共面电极的位置依赖性：电场沿着微流体通道的高度方向是不均匀的，沿着不同高度流动的颗粒会产生不同的信号峰值幅度。图3(d)为两种颗粒的负峰值幅度的散点图，两种颗粒的峰值幅度分别为(147.62±11.04)μV和(53.70±3.75)μV(两种颗粒的数量各为120个)，不同大小的颗粒峰值幅度存在着明显的偏差，可用作区分两种颗粒的可靠指标。

图3 不同大小颗粒的电阻抗信号表征

3.2 颗粒的位置预测与误差分析

为了与下游的压电分选实现良好的结合，需要对电阻抗数据进行实时记录和处理，以预测触发分选时刻颗粒在管道中所处的位置。

图4(a)所示为电阻抗信号处理的程序流程图。程序运行时，会实时的获取特定时间长度的电阻抗数据(采集区间为0.2 s，包含时间及对应的电压值)。首先，通过一次多项式拟合进行电压信号的基线消除；其次，寻找所有的波峰及波谷位置(即正负峰值的时间点)及其对应的幅度(即正负峰值的电压值)，为了实现某种特定颗粒的分选，波峰与波谷处的电压值会与预先设定的阈值作比较，如果波峰与波谷处的电压值都在设定的阈值范围内，说明此时检测到了一个想要分选的目标颗粒并获取了一个完整的正负峰值波形。然后，根据正负峰值之间的时间差以及电极间隙之间的距离计算颗粒的速度，并估计颗粒到达分选区域所需的延时。最后，给压电致动器或高速相机发送触发信号。

电阻抗检测和分选的程序流程虽然简单，但它涉及许多需要在连续流中同步的耦合过程。图4(b)所示为电阻抗信号的实时处理时序图。虚线框中为实时获取的特定时间长度的电阻抗数据，并恰好包含了一个目标颗粒的完整正负峰值波形(已经过基线消除和波峰与波谷的阈值匹配)。其中，tsum为颗粒从波谷位置到分选区域所需的总时间，是由颗粒从波谷位置到分选区域的距离除以颗粒的速度得到的；tvalley为颗粒电阻抗信号的波谷所在时刻到本次数据采集结束时刻所持续的时间；tprocess为程序运行消耗的时间(为15～25 ms)；tadjust为调整时间(为20～60 ms)；以上4个值是通过程序计算得到的。tdelay为颗粒到达分选区域所需要给定的延时，具体计算公式如下

tdelay=tsum-tvalley-tprocess-tadjust

(1)

在给定相应的延时tdelay后，给压电致动器或高速相机发送触发信号。其中，颗粒在触发时刻与波谷位置的时间差理论上与tsum是相同的，但实际上两者的差值会在±5 ms之间波动，这可能是由于计算机内核的分时复用不稳定性导致的。

图4(c)所示为10 μm的聚苯乙烯小球在速度约为5 mm/s时，经过以上程序的计算后，在触发时刻颗粒在管道中所处的位置，统计的颗粒数量为83个。可以看出颗粒基本都位于分选区域中，说明提出的方法对预测颗粒在管道中所处的位置是较为准确的。但是沿着颗粒的流动方向，颗粒分布在一个长约290 μm的区间内，表明对颗粒位置的预测存在一定误差。

图4(d)所示为使用高速相机拍摄的颗粒速度与对应电阻抗速度的相对误差。说明电阻抗测速存在一定误差。最大误差约为-5 %，这可能是造成颗粒在触发时刻在管道内位置分布范围较大的主要原因。除了颗粒测速不准带来的误差，其他可能原因有：颗粒在管道中的流动不是完全匀速的，尤其是在靠近分选区域时由于上下敲击通道的存在，颗粒速度会减慢；电极和管道的制作可能存在一定的误差；数据实时获取和处理的程序仍需要优化等。

图4 颗粒的位置预测

3.3 颗粒的分选

经过对压电分选方法的分析，能实现正确分选的区域为沿着颗粒的流动方向长约320 μm的区间内。而上文经过预测颗粒位置得到的触发区域都在合适的分选区域中，说明对颗粒位置预测的误差在实验允许的范围内，从而证实了将电阻抗检测与压电分选结合实现颗粒分选的可行性。基于此，研究了从10 μm和7 μm的混合聚苯乙烯小球中分选出10 μm的颗粒。

图5(a),(b)所示为在5 mm/s的速度下，被分选的10 μm颗粒和未被分选的7 μm颗粒在分选过程中的典型时间堆叠图像。其中，10 μm的颗粒到达合适的分选区域时，压电致动器下压使得颗粒的流动路径发生变化，并进入下行收集通道。而7 μm的颗粒通过时，压电致动器不动，颗粒被冲入废液通道。

图5 颗粒分选的时间堆叠图像

在分选实验中，将两种颗粒按数量比1︰1均匀混合。分选之前混合溶液在显微镜下的图像如图6(a)所示。

图6 分选结果的表征

在分选过程中，将用于触发分选的电阻抗信号的峰值幅度阈值区间设为100～200 μV，这样单个7 μm的颗粒或者颗粒团通过时由于峰值幅度小于或大于阈值区间而不会触发分选动作。而单个的10 μm颗粒通过时就会触发分选从而进入下行收集通道。

实验结束后，将收集腔中的溶液收集在离心管中，置于显微镜下观察并手动计算10 μm和7 μm颗粒的数量(10 μm颗粒为388个，7 μm颗粒为21个)，得到10 μm颗粒的纯度为94.9 %。图6(b)所示为分选之后收集腔内溶液在显微镜下的图像，图中圆圈包围的是7 μm颗粒。出现错误分选主要是因为不同大小的两个颗粒距离太近或者7 μm颗粒聚团通过所导致的。

由于电极到分选区域之间的距离约为1 500 μm，在颗粒速度约为5 mm/s的情况下，颗粒从电极检测到电阻抗信号到实现分选大约需要0.3 s，压电致动器下压后，需要等待颗粒流入下行收集通道后再抬起，时间约为0.3 s，所以理论上颗粒的分选通量约为每秒1.6个颗粒。

4 结 论

本文通过集成电阻抗检测技术和压电分选技术，实现了对不同大小的聚苯乙烯小球的无标记检测与分选。文中所阐述的电阻抗数据的实时记录和处理的方法可以准确预测在触发分选时刻颗粒在管道中所处的位置，从而实现了与分选动作的良好匹配。为了证明这种颗粒分选系统的性能，从混合颗粒溶液中分选出了10 μm的聚苯乙烯小球，分选纯度为94.9 %，通量为1.6 Hz。为基于电阻抗检测的无标记细胞分选技术研究开辟了一个有前途的平台。