miR-155靶向JAK/STAT3通路促进LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎性反应

谭仕廉 李艳丽 何永勋 郭 乐 申元英

炎性反应是生物组织在应对外界刺激时所发生的一种非常重要的防御反应，它可以限制炎症扩散、清除坏死组织、恢复器官功能。然而炎症也是一把“双刃剑”，当炎性反应变得不可控时，会引起细胞发生严重的变性和坏死，影响受累组织和器官的功能，还会引起增生性反应，有潜在的致癌风险[1]。巨噬细胞作为固有免疫细胞，其表面表达多种模式识别受体、趋化/活化相关细胞因子受体，具有很强的识别吞噬和杀伤清除病原体能力，同时作为专职抗原递呈细胞，还具有摄取、加工递呈抗原引发适应性免疫应答的能力，因此是最早对机体稳态紊乱做出反应的细胞之一，在机体炎症中起到非常重要的调控作用[2]。

microRNAs(miRNAs)是一类非编码单链小RNA分子，在转录后水平上调控基因表达，以控制细胞分化、发育和稳态，细胞外miRNAs还可在各种生理和病理过程中介导细胞间的通信[3]。近年来，越来越多的证据表明，miRNAs在炎性反应中发挥了重要的调控作用[4, 5]。miR-155已被证实通过多种方式参与调控炎性反应，作为一个重要的“亲炎症”miRNAs备受关注[6,7]。本实验使用LPS处理THP-1巨噬细胞构建细胞炎性模型，检测miR-155对炎性细胞因子及相关基因表达的影响，探讨miR-155在THP-1巨噬细胞炎性反应中的作用及其机制，为miR-155调控炎性反应增添新的认识。

材料与方法

1.细胞系和主要试剂：人单核细胞THP-1(TCHu 57)由中国科学院上海细胞库提供。胎牛血清购自美国Gibco公司。RPMI1640培养基购自美国Corning公司。佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA) 购自大连美仑生物技术有限公司。LPS(055:B5)购自爱必信(上海)生物科技有限公司。总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒均购自诺唯赞公司。miRNA外参、miRNA反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。Lipofectamine 2000 脂质体购自美国Thermo Fisher Scientific公司。miR-155 mimics序列上游引物：5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUU-3′，下游引物：5′-CCCCUAUCACGAUUAGCAUUAAUU-3′；mimics NC序列上游引物：5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′，下游引物：5′-GUACUUUUGUGUAGUACAAUU-3′，均设计合成于上海生工生物公司。TNF-α和IL-1β ELISA试剂盒购自四正柏生物科技有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术公司。10×电转液、5×Tris电泳液和彩色预染蛋白均购自北京索莱宝科技有限公司。β-actin一抗、STAT3一抗、p-STAT3一抗、羊抗兔二抗均购自美国Cell Signaling Technology公司。

2.THP-1细胞培养和分化：THP-1单核细胞培养在含有10%胎牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸的RPMI1640培养基中，于37℃、5%CO2的培养箱中孵育培养；在细胞处于对数生长期且状态良好时加入浓度为100ng/ml的PMA诱导48h，THP-1单核细胞逐渐由悬浮的体积较小、透亮的圆形细胞变为贴壁的体积较大、中心较暗的圆形或椭圆形细胞，且形状不规则，少数细胞伸出伪足成为梭型，呈现巨噬细胞形态，表明细胞已诱导分化为THP-1巨噬细胞。

3.毒性试验：用CCK-8法检测LPS对THP-1巨噬细胞活力的影响。在96孔板中加入1×104个THP-1细胞，经PMA诱导48h后，再与不同浓度(1、10、100、1000、10000ng/ml)的LPS孵育24h。按体积比1∶10混合CCK-8溶液和1640培养基，每孔加入100μl，37℃培养4h，用全自动多功能酶标仪在波长450nm处测定吸光度(A)值。

4.细胞转染：按照转染试剂说明书，分别将Lipofectamine2000 脂质体与miRNA-155 mimics或mimics NC以体积比1∶50均匀混合，冰上静置融合20min后缓慢加入到已分化的THP-1巨噬细胞中，摇晃均匀培养6h，更换为1640完全培养基继续培养至48h后进行后续实验。

5.总RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)：采用 TRIzol 法提取各组THP-1巨噬细胞总RNA后，反转录为cDNA，再用RT-qPCR试剂盒扩增上述cDNA并分析其对应的mRNA表达。引物均由上海生工生物公司合成，主要基因引物序列详见表1。

表1 主要基因的引物序列

6.ELISA法检测细胞上清中炎性细胞因子的含量：收集各组THP-1巨噬细胞上清，按照TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒操作步骤，检测细胞上清在450nm处的A值，根据吸光值绘制标准曲线，分别计算出细胞上清中TNF-α、IL-1β的含量。

7.Western blot法分析蛋白表达：将2×106个/孔接种于6孔细胞板，分组为control组(对照组)、LPS组、miR-155 mimics+LPS组、miR-155 mimics 组、mimics NC+LPS组、mimics NC 组。RIPA裂解细胞以提取总蛋白，经BCA蛋白定量检测试剂盒进行定量。取含 20μg 蛋白的裂解液，经12.5% SDS-PAGE 120V电泳2h，再转移至PVDF膜，以5%脱脂奶粉封闭1h后用PBS漂洗3次，每次5min，加入特异性一抗于4℃冰箱孵育过夜。次日 PBST 漂洗3次，每次5min，加入二抗室温孵育1h后，再用PBST漂洗3次，每次5min，经ECL曝光成像。

结 果

1.LPS对THP-1巨噬细胞的毒性作用:使用不同浓度(1、10、100、1000、10000ng/ml)的LPS处理已分化的THP-1巨噬细胞24h，CCK-8法检测细胞活性。LPS处理后的细胞活力与未处理细胞比较，差异无统计学意义(P>0.05，图1)，说明实验所用LPS最大浓度(10000ng/ml)对THP-1巨噬细胞无毒性作用。

图1 LPS对THP-1巨噬细胞的毒性作用

2.LPS上调THP-1巨噬细胞中miR-155的表达：RT-qPCR结果显示，不同浓度LPS处理1.5h后均上调了THP-1巨噬细胞中miR-155的表达，且呈浓度依赖性，在处理时表达最高(P<0.001，图2)。后续使用浓度为100ng/ml的LPS，探究miR-155在调控巨噬细胞炎症中发挥的作用。

图2 不同浓度LPS诱导THP-1巨噬细胞miR-155的表达

3.转染miR-155 mimics明显促进THP-1巨噬细胞中miR-155的表达：RT-qPCR结果显示，转染miR-155 mimics后THP-1巨噬细胞中miR-155表达显著上调(P<0.001，图3)，成功构建过表达miR-155细胞系。

图3 构建miR-155过表达的THP-1巨噬细胞

4.过表达miR-155促进LPS诱导的THP-1巨噬细胞中TNF-α和IL-1β表达：RT-qPCR结果显示，100ng/ml LPS处理1.5h显著上调了THP-1巨噬细胞中TNF-α和IL-1β mRNA的表达(P<0.001，图4中A和B)，过表达miR-155促进了LPS诱导的TNF-α和IL-1β mRNA的表达(P<0.001，图4中A和B)；ELISA结果显示，100ng/ml LPS处理1.5h后，THP-1巨噬细胞上清中TNF-α和IL-1β分泌增加(P<0.001，图4中C和D)，过表达miR-155进一步增加了LPS诱导的TNF-α和IL-1β分泌(P<0.001，图4中C和D)。分泌水平和mRNA水平结果一致。

图4 过表达miR-155对THP-1巨噬细胞炎性细胞因子表达的影响A.miR-155对THP-1巨噬细胞中TNF-α mRNA表达的影响；B.miR-155对THP-1巨噬细胞中IL-1β mRNA表达的影响；C.miR-155对THP-1巨噬细胞上清中TNF-α分泌的影响；D.miR-155对THP-1巨噬细胞上清中IL-1β分泌的影响

图5 miR-155对JAK/STAT3信号通路蛋白的影响A.miR-155对THP-1巨噬细胞中STAT3 mRNA表达的影响；B.miR-155对THP-1巨噬细胞中STAT3蛋白和p-STAT3蛋白表达的影响

5.过表达miR-155对LPS诱导的JAK/STAT3信号通路蛋白的影响：RT-qPCR结果显示，LPS上调THP-1巨噬细胞中STAT3 mRNA水平表达(P<0.05)，过表达miR-155后进一步增加了STAT3 mRNA水平的表达(P<0.01，图5A)；Western blot法分析显示，LPS升高THP-1巨噬细胞中JAK/STAT3信号通路蛋白p-STAT3蛋白表达，过表达miR-155后也进一步增加p-STAT3蛋白表达(图5B)。蛋白水平结果与基因水平结果一致。

讨 论

大量证据表明炎性反应的发生、发展与miRNAs的失调紧密相关。有研究者分析发现炎性结肠组织中存在多种miRNAs异常表达，例如miR-21、miR-30b、miR-34c-5p、miR-146a、miR-155、miR-196a等表达增加，是炎性反应和纤维化过程中重要的调节因子，有望作为克罗恩病的生物学标志物[8]。Pathak等[9]研究揭示miR-155在溃疡性结肠炎患者的肌成纤维细胞(intestinal myelofibrosis, IMF)中显著上调，通过靶向抑制SOCS-1蛋白的表达，激活IMF炎症表型，增加IL-6和IL-8的释放，从而加重了患者肠道炎性反应。孙广等[10]研究发现，miR-155在类风湿性关节炎患者血清外泌体中表达上调，并且与类风湿性关节炎疾病发生和严重程度有关。

巨噬细胞存在于所有组织中，几乎参与调控机体生物学的各个方面，从发育、稳态到组织修复，以及作为免疫细胞在调节免疫、炎性反应中也发挥核心作用[11]。近年来有研究发现，激活表型多样性是巨噬细胞生物学中与疾病评估最密切相关的指标，可用于预测疾病的炎症状态以及癌症的生存率[12]。另外有研究显示，动脉粥样硬化中炎症的主要解决办法是使炎症性巨噬细胞的表型转化为抑制炎症和促进愈合的巨噬细胞，突出了维持巨噬细胞稳态在炎症性疾病防治中的重要性[13]。一项基于miRNAs调控巨噬细胞炎性反应研究发现，miR-155和miR-146a能够严格调节巨噬细胞炎性反应的“开启”和“关闭”，miR-155表达升高导致了miR-146a缺陷小鼠出现过度的炎性反应，从而强调了miR-155在促进巨噬细胞炎症中的主导功能[14]。本研究结果同样证实，miR-155 在LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎性反应中表达上调，通过影响相关信号通路转导及炎性细胞因子的表达，促进了THP-1巨噬细胞的炎性反应。

研究表明促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β在许多炎症性疾病的发病机制及疾病进展中起重要的推动作用[15, 16]，同时与体内外炎症和巨噬细胞活化的严重程度紧密相关[17]。实验者发现miR-155转基因小鼠在暴露于LPS时产生更高水平的TNF-α，推测miR-155很可能是直接靶向参与调控LPS信号转导蛋白的mRNA表达，如fas相关的死亡结构域蛋白、IκB激酶ε、和受体相互作用的丝氨酸-苏氨酸激酶1，同时增强TNF-α的翻译[18]。在本研究中，TNF-α、IL-1β的表达量指示LPS诱导的THP-1巨噬细胞中炎症的严重程度。通过RT-qPCR和ELISA两种方法测定miR-155对TNF-α、IL-1β表达的影响，实验结果表明miR-155在基因水平和蛋白水平上均表现出对TNF-α、IL-1β产生的促进作用(图4)。

JAK/STAT信号通路是多种细胞因子和生长因子在细胞内传递信号的共同途径，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及炎症等多种生理过程[19]。研究已证实JAK/STAT信号通路失调可导致多种炎性反应的发生[20]。p-STAT3 作为炎性反应的响应因子之一，是STAT3与受体结合后实现其磷酸化活化，然后形成同/异二聚体并入核，与相应的靶基因启动子结合而激活相应的基因转录和表达[21～23]。在本实验中，miR-155 在LPS诱导THP-1巨噬细胞中可以有效促进转录因子STAT3的磷酸化活化，进而调控JAK/STAT3信号通路发挥促炎作用。

综上所述，miR-155促进LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎性反应，其机制与引起p-STAT3磷酸化，促进JAK/STAT3信号通路激活，导致炎性细胞因子TNF-α和IL-1β高表达有关。本研究证明了miR-155的促炎作用，为miR-155在巨噬细胞炎症网络中发挥的作用增添新的认识，给靶向巨噬细胞炎症以防治炎症性疾病提供了新的视角，miRNA治疗也有望开启炎症治疗的新时代。