食品中大肠菌群能力验证结果分析

种 婷

（辽宁省检验检测认证中心，辽宁沈阳 110032）

大肠菌群是一群革兰氏阴性无芽孢杆菌，能发酵乳糖，产酸产气，一般用来作为食品是否受到粪便污染的卫生指示菌[1]。粪便中可能含有肠道致病菌，如沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌等，食用受到粪便污染的食品具有潜在危害，所以大肠菌群检测在食品微生物检验中具有重要意义[2]。

能力验证是利用实验室间比对，来评价实验室检测能力的一种重要方式[3]。本实验室报名参加辽宁省市场监督管理局组织的食品中大肠菌数计数能力验证，按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》（GB 4789.3—2016）检验，2名检验员对同一质控样品进行检验。通过参加能力验证，提高本实验室检测人员的技术水平，加强实验室质量控制，确保出具的检测结果准确可靠。

1 材料与方法

1.1 样品

辽宁省市场监督管理局发放的编码为W033质控样。在生物安全柜内将含有大肠菌群的西林瓶打开，加入少量（2～4 mL）无菌生理盐水进行溶解，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，反复用余下的无菌生理盐水清洗西林瓶内壁，回收无菌生理盐水，并放入上述无菌瓶中，稀释液合计40 mL，此溶液即为待测样品。吸取待测样品25 mL加入225 mL无菌生理盐水中，充分溶解，均质混匀。

1.2 仪器与试剂

KB240型电热恒温培养箱（德国Binder公司）；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；CX31型显微镜（日本Olympus公司）；KG-SX-700高压灭菌锅（日本Tomy Kogoy公司）；均质器（法国梅里埃公司）；MICROFLEX LT/SH基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（德国布鲁克公司）。

结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Agar，VRBA）、煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）、肉汤（美国BD公司）；伊红美蓝琼脂（Eosin-Methylene Blue Agar）、革兰氏染色液试剂盒（北京陆桥技术股份有限公司）；氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）（德国Bruker公司）。

1.3 试验方法

依据作业指导书以及《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》（GB 4789.3—2016）第二法大肠菌群平板计数法，2名检验员同时进行检验。

2 结果与分析

2.1 可疑菌落计数

VRBA平板上有3种菌落形态，各不同菌落形态见表1。不同菌落形态的菌落数见表2。

表1 VRBA平板上菌落形态

表2 VRBA平板不同形态菌落计数

2.2 确证试验

选取1∶10和1∶100稀释度VRBA平板上各10个不同类型典型和可疑菌落，接种至BGLB肉汤管中，36 ℃培养24～48 h，观察产气情况，结果见图1，凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性（+），结果见表3。为了确保结果准确可靠，将典型菌落和可疑菌落分别接种至EMB平板，同时革兰氏染色镜检观察，结果分别见图2和图3。

图1 典型菌落和可疑菌落在BGLB肉汤中生长情况

表3 确证试验BGLB肉汤结果

图3 革兰氏染色镜检结果

2.3 样品结果报告

经证实，大肠菌群阳性的试管比例乘以相应稀释度VRBA平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每mL样品中大肠菌群结果，因此样品W033结果报告为 3 600 CFU/mL。

3 结论与讨论

GB 4789.3—2016标准中第一法MPN计数适用于检测大肠菌群含量较低的食品；第二法平板计数法适用于检测大肠菌群含量较高的食品，本次试验采取平板计数法进行检验[4]。平板计数法用结晶紫中性红胆盐培养，分2次倾注平板。第1次倾注平板时要有一定的厚度，给细菌提供充足的营养。第2次倾注平板，能防止细菌蔓延生长；降低需氧菌生长速度；截留大肠菌群产生的气体，观察产气 情况。

BGLB发酵管有明显不同，可疑菌落接种的BGLB肉汤管培养24 h无变化，培养至48 h时，不仅产气，而且BGLB肉汤变黄。为了确证该菌是否属于大肠菌群，将产气不变色和产气变黄的BGLB肉汤均划线接种至EMB平板，36 ℃培养24 h，产气不变色的BGLB肉汤划线接种在EMB平板上生长的菌落具有大肠杆菌的典型特征，紫黑色菌落，带有绿色金属光泽。产气变黄的BGLB肉汤划线接种在EMB平板上生长的菌落呈现淡粉色，表面湿润。经革兰氏染色镜检VRBA平板上生长的3种不同形态的菌均为革兰氏阴性杆菌。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对3种菌进行快速鉴定，鉴定结果显示典型菌落1为大肠杆菌（分值2.235），典型菌落2为大肠杆菌（分值2.367），可疑菌落3为克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌，分值2.286）。克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）属于肠杆菌属，其特征符合大肠菌群的定义，故其数量应计算在结果中[5]。

参加能力验证时应注意：①运输过程中温度控制是否达标，温度波动过大，对计数型质控样菌数有较大影响；②收到样品后要第一时间冷藏保存，若冷冻保存，易导致结果异常；③样品在水化前是否使样品恒温到室温，若快速升温易造成细胞破裂，导致结果出现偏差[6]；④均质时间要适宜，若均质时间过短，冷冻干燥的样品溶解不充分，其中的菌体团没有完全分散开，易造成结果偏低；⑤应在 15 min内完成试验，操作时间过长会导致菌体死亡，导致结果偏低。

经能力验证组织机构反馈，本实验室W033大肠菌群的检测结果|Z|＜2，结果满意[7]。本次能力采取人员比对来减小操作误差，以确保检测结果可靠。2名检验员检测结果基本一致，说明本次能力验证基本无人为误差。本次能力验证所用的培养基及试剂均经过《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28—2013）验证，符合试验要求。通过本次能力验证，可提高本实验室大肠菌群检测能力以及本实验室的竞争力。