气相色谱-串联质谱法同时测定水产干制品中 9种挥发性N-亚硝胺

陈红波，罗振玲，陆 正

（台州市食品检验检测中心，浙江台州 318000）

N-亚硝胺是一类公认的致癌物质，广泛存在于食品原料、饮用水、肉制品、水产制品中，结构通式为R2(R1)N-N=O，分为挥发性和非挥发性两类，大多数挥发性N-亚硝胺是强致癌物质。含蛋白质的食品在加工过程中分解的胺类物质可与硝酸盐/亚硝酸盐生成N-亚硝胺，目前研究较多的有N-二甲基亚硝胺（N-dimethylnitrosamine，NDMA）、N-二乙基亚硝胺（N-diethylnitrosamine NDEA）、N-亚硝基甲 乙 胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-二丙基亚硝胺（N-dipropyl Nitrosamine，NDPA）、N-二丁基亚硝胺（N-dibutyl nitrosamine，NDBA）、N-亚硝基哌啶（N-nitroso Piperidine，NPIP）、N-亚硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亚硝基吗啉（N-nitrosomorphine，NMOR）和N-亚硝基二苯胺（N-nitroso Diphenylamine，NDPhA）9种挥发性亚硝胺[1]。

水产干制品基质复杂，监测其中的N-亚硝胺含量，提取净化方法是关键。现已报道的样品前处理方法有水蒸气蒸馏法[2]、液液萃取法[3]、固相萃取法[4]、QuEChERS[5]等方法。《食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定》（GB 5009.26—2016）采用的提取净化方法为水蒸气蒸馏、液液萃取和旋转蒸发，提取方式烦琐，过程复杂，耗时长，且蒸馏浓缩时挥发性目标物易损失。因此，优化或开发新的N-亚硝胺前处理方法是目前研究的热点。N-亚硝胺的检测方法有紫外和可见分光光度法、薄层色谱法、气相色谱法、气相色谱-热能分析仪法、气相色谱-质谱法、气相色谱-质谱/质谱法和液相色谱-质谱/质谱法等。众多方法中常用的是气相色谱-质谱联用法，但该方法在检测食品中N-亚硝胺等小分子化合物时易受基质影响，产生较强的基质效应、本底信号高或假阴性等问题。而串联质谱法可有效减少样品基质的干扰，提高检测结果的准确性和可靠性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

串联三重四极杆气相质谱联用仪，Agilent 7890B+7000D型，美国安捷伦科技公司；涡旋震荡仪，德国heidolph公司；离心机，ThermoFisher SCIENTIFIC。

1.1.2 试剂与耗材

乙腈，TEDIA，色谱纯；二氯甲烷，TEDIA，色谱纯；氯化钠，天津市鼎盛鑫化工有限公司，分析纯；硫酸，浙江汉诺化工科技有限公司，分析纯；无水硫酸镁，阿拉丁，分析纯；PRiME HLB固相萃取小柱，Waters Oasis；EMR净化管，美国安捷伦科技公司。

1.1.3 标准物质

9种亚硝胺混 标（NDMA(CAS 62-75-9)、NDEA(CAS 55-18-5)、NDPA(CAS 621-64-7)、NPYR(CAS 930-55-2)、NPIP(CAS 100-75-4)、NDBA(CAS 924-16-3)、NMEA(CAS 10595-95-6)、NDPhA(CAS 86-30-6)、NMOR(59-89-2））浓度分别为2 000 mg/L，1 mL，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 试验样品

鱿鱼丝、章鱼干、墨鱼干、水潺干、大黄鱼鲞和虾干。

1.3 试验方法

1.3.1 水产干制品样品前处理（1）水蒸气蒸馏法。准确称取20 g（精确至 0.01 g）试样，加入20 mL水和10 g氯化钠于蒸馏管中，充分混匀，检查气密性。在250 mL蒸馏烧瓶中加入 20 mL二氯甲烷及少量冰块用以接收冷凝液，冷凝管出口伸入二氯甲烷液面下，并将平底烧瓶置于冰浴中，开启蒸馏装置加热蒸馏，收集50 mL冷凝液后关闭加热装置，停止蒸馏。在盛有蒸馏液的平底烧瓶中加入5 g氯化钠和3 mL的硫酸（1+3），搅拌使氯化钠完全溶解。然后将溶液转移至250 mL分液漏斗中，振荡5 min，必要时放气，静置分层后，将二氯甲烷层转移至另一平底烧瓶中，再用60 mL二氯甲烷分3次提取水层，合并4次二氯甲烷萃取液。将二氯甲烷提取液用适量无水硫酸钠脱水后，进行旋转蒸发，于40 ℃水浴上浓缩至5～10 mL改氮吹，并准确定容至1.0 mL，摇匀后测定。

（2）QuEChERS-EMR法。准确称取10 g（精确至0.01 g）试样，加入10 mL水浸泡30 min后加入 10 mL乙腈涡旋1 min，加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠超声15 min后涡旋2 min，离心5 min后取出上清液加入到EMR净化管中，EMR净化管事先已用5 mL水活化。净化管涡旋10 min后离心5 min，取出上清液加入0.4 g氯化钠和1.6 g无水硫酸镁涡旋2 min后离心。取上清液4 mL氮吹至近干，加入 0.4 mL乙腈，经滤膜过滤至有内插管的进样小瓶后测定。

（3）固相萃取法。准确称取2 g（精确至0.01 g）样品，加入10 mL乙腈后涡旋振荡1 min，超声 15 min，离心5 min。取5.0 mL上清液过PRIME HLB固相萃取小柱，净化液氮吹至近干，加入 0.5 mL乙腈，经滤膜过滤后测定。

1.3.2 标准溶液配制

①标准储备液A。取9种亚硝胺混标1 mL用乙腈稀释至20.00 mL浓度为100 μg/mL，取0.1 mL该溶液用乙腈稀释至10 mL，浓度为1 000 ng/mL。②标准储备液B。取标准储备液A 0.1 mL用乙腈稀释至10 mL，浓度为10 ng/mL。③标准曲线溶液。分别准确移取标准储备液A 1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、 20 μL、50 μL、100 μL、200 μL和500 μL用乙腈稀释至1.0 mL，浓度分别为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL和500 ng/mL。

1.3.3 色谱和质谱条件

（1）色谱条 件。VF-WAXms柱（30 m×250 μm× 0.25 μm）；高纯氦气；进样量1 μL；脉冲不分流进样模式；进样口250 ℃；柱流速1.0 mL/min恒流；柱温：50 ℃保持1 min，然后以15 ℃/min升温至100 ℃保持1.5 min，再以5 ℃/min升温至115 ℃保持1 min，再以40 ℃/min升温至220 ℃保持8 min。

（2）质谱条件。扫描方式MRM模式；EI源电离，电压70 eV；离子源温度250 ℃；四极杆温度（Q1和Q2）150 ℃；传输线温度280 ℃。9种挥发性N-亚硝胺的MRM条件如表1所示。

表1 9种挥发性N-亚硝胺的MRM条件

2 结果与分析

2.1 前处理方法选择

水蒸气蒸馏法是将《食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定》（GB 5009.26—2016）方法中的样品称样量由200 g缩减至20 g，虽然样品量减少能避免蒸馏不充分的缺点还能避免干扰和系统污染问题，但操作仍然复杂、步骤多、耗时长，有机溶剂消耗量大，N-亚硝胺在加热浓缩过程中极易丢失，回收率不稳定。QuEChERS-EMR法样品称样量小能避免干扰和系统污染问题，前处理过程与水蒸气法相比比较简便，快速有效，实现了N-亚硝胺在水产干制品样品中的高回收率和稳定性，净化效果较好。固相萃取法样品称样量小能避免干扰和系统污染问题，所用的PRiME HLB固相萃取小柱无需活化可直接上样，样品溶液通过后，无需对小柱进行淋洗，操作简单，快速有效。

选取鱿鱼丝试样进行加标试验（加标浓度 80 μg/kg），比较3种前处理方法的回收率，3种前处理方法均能实现对干制水产品中9种挥发性N-亚硝胺类化合物的检测。HLB固相萃取法操作最简单，快速有效，净化效果较好，详见图1。

图1 3种前处理方法的回收率图

2.2 试验条件选择

挥发性N-亚硝胺类物质多用气相色谱质谱法检测，国家标准《食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定》（GB 5009.26—2016）中第一法也是采用气相色谱质谱法，但化合物只经过一次筛选，本底信号高，基质影响较明显，容易产生假阴性或假阳性结果。因此选用三重四极杆气质联用仪的MRM多反应离子监测模式。MRM多反应离子监测即母离子被选定，碰撞后，从形成的子离子中再次选定进行监测。经过2次筛选，MRM模式比SIM模式具有更强的降噪性能，因此采用MRM多反应离子监测模式可以极大地去除基质带来的干扰。由图2可知，样品的总运行时间25 min，实现了一次进样同时分析9种化合物，大大提高了分析效率。在MRM多反应离子监测模式下，各化合物经过定量离子对与定性离子对的提取，均实现了完美分离，且各化合物均无基质干扰，响应良好，能够很好地实现水产干制品中9种N-亚硝胺类化合物的定性与定量分析。

图2 9种挥发性N-亚硝胺的总离子流图

2.3 方法线性及检出限

取标准储备溶液B 60 μL加入到2 g样品中，按照固相萃取法进行样品前处理，当各化合物的信噪比≥3时，该浓度即可确定为该化合物的检出限浓度。由表2知，各化合物在1～500 μg/L（0.5～ 250.0 μg/kg）的浓度下，相关系数为0.999 6～0.999 9， 线性关系良好，检出限为0.3 μg/kg，满足检测 需求。

表2 9种N-亚硝胺类化合物的标准曲线及线性范围

2.4 精密度与回收率

称取2 g鱿鱼丝样品18份，6份分别准确加入标准储备液A 50 μL（对应加标浓度25 μg/kg），6份分别准确加入标准储备液A 100 μL（对应加标浓度 50 μg/kg），6份分别准确加入标准储备液A 200 μL（对应加标浓度100 μg/kg），按照固相萃取法进行样品前处理，分别计算6份样品的精密度和回收率。由表3可知，9种N-亚硝胺类化合物的加标回收率为70.1%～87.7%，精密度为1.6%～8.1%，回收率与精密度均满足国家标准《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）中相关规定，满足检测需求。

表3 回收率及精密度

2.5 样品检测

称取粉碎混匀后的各试样，选用固相萃取法进行样品前处理，鱿鱼丝、章鱼干、墨鱼干、水潺干、大黄鱼鲞和虾干样品中均有NDMA检出，除NDMA外其他8种N-亚硝胺类化合物均未检出。

3 结论

建立了水产干制品中9种挥发性N-亚硝胺的三重四极杆气质联用仪检测方法，选用3种试样前处理技术进行比较，3种前处理方法均能实现水产干制品中9种挥发性N-亚硝胺的检测，净化效果较好，回收率与稳定性均较高，都能满足检测需求，但HLB固相萃取法更简便快速有效。选用固相萃取法进行实验，在0.5～250 μg/kg质量浓度下，各化合物的响应值与浓度呈良好的线性关系（r＞0.999 6），方法检出限为0.3 μg/kg。取鱿鱼丝样品分别进行3个不同浓度水平的加标实验，回收率为70.1%～87.7%，精密度为1.6%～8.1%。取本地不同品种水产干制品进行检测，各样品中均检出NDMA。方法前处理简单，灵敏度高，适用于水产干制品中9种挥发性N-亚硝胺的同时检测。