超声波处理影响玉米种子活力的转录组分析

刘鹏飞， 李坪遥， 刘 君， 麦嘉埼， 周捷成， 梁日朗， 蒋 锋

(1.仲恺农业工程学院农业与生物学院， 广州 510225；2.广州市特色作物种质资源研究与利用重点实验室， 广州 510225)

玉米是我国的主要粮食作物，在国民经济发展中具有举足轻重的地位[1]。我国玉米播种的区域跨度和地方气候差异较大，而高活力种子可有效减少不良环境和有害微生物对种子的影响，保证苗齐苗壮，对确保作物产量十分必要[2]。因此，高活力的玉米种质资源是玉米产业发展的重要需求。

超声波是一种绿色无污染的物理处理手段，目前研究表明，适度超声波处理可提高种子发芽率，促进种子萌发和生长[3-11]。黎国喜等[12]研究发现，超声波处理过的水稻种子，其促进种子活力的效应可以延续到水稻后期生长发育及产量。陈晓辉等[13]发现，超声波处理可以显著促进玉米种子的萌发；吴海燕[14]研究发现，超声波处理不仅能促进玉米种子萌发，而且能显著促进玉米植株的生长发育，提高株高、茎粗、叶长和叶宽，利于光合产物的产生和积累。转录组广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合[15]。关于种子活力的相关转录组分析已在水稻[16]、花生[17]、黄芪[18]等植物方面有相关报道。基于转录组测序技术，对玉米在高温胁迫、盐胁迫、根系耐旱性[19-24]等逆境条件下的基因调控及差异基因表达等方面也有一定的研究。目前，超声波在种子活力上的研究大都集中在超声波对种子萌发、生长发育及产量因素的影响，通过测定与种子活力相关的表型性状及生理生化指标等来揭示超声波处理对种子活力的影响[25-27]。

目前针对超声波促进种子活力的机理研究较少，尤其是分子机理研究方面鲜有报道。本研究通过超声波处理方法，对糯玉米自交系N 51种子进行不同时长处理，分析不同处理时长对玉米种子活力的影响及规律。通过转录组学分析超声波处理下玉米种子与活力相关的差异表达基因以及通过GO数据库注释和KEGG数据库分析，为解析超声波处理促进种子活力及相关分子机理研究提供一条探究之路。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试玉米材料来源于广州市岭南特色作物种质资源研究与利用重点实验室自主选育的糯玉米(ZeamaysL.sinensisKulesh)自交系N 51。选取籽粒饱满且大小一致的种子作为试验材料。

1.2 处理及取样

取糯玉米种子清水浸泡12 h后放入超声波清洗仪(KQ 3200 E型，40 kHz，150 W)中，分别处理5 min(T 1)、10 min(T 2)、15 min(T 3)，以未经超声波处理的玉米种子即处理0 min作为对照(ck)。处理结束后放入人工气候箱(恒温28 ℃，16 h光照，8 h黑暗)中进行发芽试验，设3次重复，每次重复50粒。

以种子露白为萌发标准，从24 h后开始每隔12 h记录种子的萌发数，直至对照组种子萌发结束。试验过程中，筛选种子萌发率差异显著的超声波处理时长，并基于种子萌发差异显著的时间点进行取样，进行转录组测序分析。

萌发率(%)=(种子萌发数/供试种子数)×100%；

萌发速率为每12 h增加的萌发种子数，指标测定3次取平均值。

1.3 转录组测序

对玉米样品进行总RNA的提取、mRNA的富集、文库构建和质检。质检合格后开始进行转录组测序分析, 测序工作委托广州基迪奥生物科技有限公司完成。首先对原始数据进行质控，过滤低质量数据，留取高质量的序列片段进行后续分析。将留取的高质量的序列片段与玉米的核糖体数据库进行对比，去除比对上核糖体的序列片段，保留未比对上的序列片段。随后将未比对上的序列片段对比到玉米参考基因组：Zeamays.B73_RefGen_v4进行比对分析；根据比对结果，利用Stringtie重构转录本，并利用RSEM计算每个样本中所有基因的表达量，获得序列的表达量数据和归一化校正后的基因表达量FPKM值，基于各样本表达量结果，通过PCA分析和计算样本间pearson相关系数，考查样品之间重复性。基于基因表达水平分析中得到的序列片段的表达量数据，利用DESeq 2软件对数据进行组间差异分析，基于差异分析结果，筛选FDR<0.05且|log2FC|>1的基因为显著差异基因用于后续分析。利用GO数据库和KEGG数据库对差异基因的功能和信息进行分析和挖掘。

2 结果与分析

2.1 不同时长超声波处理对玉米种子活力的影响

对不同时长超声波处理玉米种子的萌发试验结果表明，以0 min(ck)、5 min(T 1)、10 min(T 2) 和15 min(T 3)共4个时长对玉米种子进行处理，各处理组的萌发率均高于ck且各处理组间萌发率具有差异，其中10 min时长处理的效果最好，萌发率最高，种子在36 h时萌发生长差异最显著(如图1)。ck、T 2和T 3处理下，糯玉米自交系N 51种子活力呈先上升和后下降的趋势。

注：ck表示对照组(未进行超声波处理)，T 1表示超声波处理5 min，T 2表示超声波处理10 min，T 3表示超声波处理15 min。图1 玉米种子在不同超声波时长处理下不同时间的发芽率Fig.1 The germination rate of corn seeds at different time under different ultrasonic durations

2.2 测序数据质量评估

本试验对ck、T 2、T 3 三个处理共9个样本进行转录组测序分析，获得大量原始数据(Raw Reads)，筛选得到Clean Reads，随后分析Clean Reads 的碱基组成及质量分布以及评估数据质量。结果显示，每个样品中的Clean Reads碱基质量为Q 20的碱基数目比例均高达97.6%以上，碱基质量为Q 20的碱基数目比例均高达93.4%以上，各生物学重复之间QC含量差异不大，而且所有样品的QC含量均高于56.8%，表明过滤后的Clean Reads碱基识别准确度可靠，Reads质量高，可用于下一步分析。

2.3 Clean Reads序列比对分析

为避免rRNA残留，将Clean Reads与玉米的核糖体数据库进行比对，除掉比对上核糖体的Reads，获得过滤rRNA后测序片段数(Unmapped Reads)，然后将Unmapped Reads与玉米参考基因组(Zeamays.B73_RefGen_v4)进行比对分析，结果显示，测序所得数据利用率较高，有效Reads总比对率均达到89.94%以上，而且唯一比对上参考基因组的有效Reads所占比例高，均达到87.44%以上，多处比对上参考基因组的有效Reads比例很低，均不超过2.61%。同时每个样品中至少89.90%的有效Reads均比对到外显子区域。根据比对结果，利用Stringtie重构转录本，并利用RSEM计算每个样本中所有基因的表达量和得到不同基因在样本中的表达量，用于后续差异分析。

2.4 样本相关性评估

本试验通过计算皮尔逊相关系数r来衡量样品间的相关性，根据Z-score绘制热图(图 2)对不同样品间的生物学重复相关性进行可视化分析，结果表明玉米的9个样品中重复之间相关性高，不同处理间相关性低，可进行下一步分析。

2.5 差异基因筛选

36 h处理时，糯玉米自交系N 51种子萌发率在ck、T 2、T 3这3个处理间，呈先升后降的趋势，故筛选出基因表达量呈现先升后降趋势的基因857个以及先下降后上升趋势的基因848个，记为Cluster 1和Cluster 2(图 3)。

2.6 差异基因功能分析

对Cluster 1基因和Cluster 2基因进行GO功能注释。发现Cluster 1基因(图 4)在生物过程类别中注释到21个亚类，主要注释在细胞过程(425个)、代谢过程(401个)、单一生物过程(273个)中；在分子功能类别中注释到了13个亚类，主要注释在结合(360个)和催化活性(314个)；在细胞组成类别中注释到了14个亚类，主要注释在细胞(395个)、细胞组分(388个)和细胞器(295个)中。

Cluster 2基因(图 5)在生物过程类别中注释到了18个亚类，主要注释在代谢过程(428个)、细胞过程(416个)和单一生物过程(295个)中；在分子功能类别中注释到了13个亚类，主要注释在催化活性(397个)和结合(370个)中；在细胞组成类别中注释到了13个亚类，主要注释在细胞(338个)、细胞组分(338个)和膜(277个)中。

对Cluster 1基因和Cluster 2基因进行GO富集分析，选取富集分析结果中FDR值最小的前20绘制GO term显著富集柱状图(图 6)，结果显示，Cluster 1基因主要富集在叶绿体(GO：0009507)、质体(GO：0009536)、类囊体(GO：0009579)、叶绿体部分(GO：0044434)、质体部分(GO：0044435)、叶绿体类囊体(GO：0009534)、类囊体部分(GO：0044436)、质体类囊体(GO：0031976)、类囊体膜(GO：0042651)和光合膜(GO：0034357)等term 中。

Cluster 2基因(图 7)主要富集在细胞外围(GO：0071944)、细胞外区域(GO：0005576)、质膜(GO：0005886)、活性氧代谢过程(GO：0072593)、细胞多糖代谢过程(GO：0044264)、半纤维素代谢过程(GO：0010410)、胞间连丝(GO：0009506)、细胞结合(GO：0030054)、细胞间连接(GO：0005911)、共质体(GO：0055044)、过氧化氢分解代谢过程(GO：0042744)、细胞壁多糖代谢过程(GO：0010383)、氧化还原过程(GO：0055114)等term中。

注：ck表示对照组(未进行超声波处理)；UL 1表示超声波处理10 min；UL 2表示超声波处理15 min。 图2 9个玉米样本的相关性热图 Fig.2 The correlation heat map of 9 corn samples

图3 Cluster1和Cluster2基因表达模式 Fig.3 Cluster1 and Cluster2 gene expression pattern

对Cluster 1和Cluster 2基因显著富集的term进行共富集分析，发现其共同显著富集的term数是7个(图 8)，分别是氧化还原过程(GO：0055114)、对氧化应激的反应(GO：0006979)、幼苗发育(GO:0090351)、对非生物刺激的反应(GO：0009628)、激素水平的调节(GO：0010817)、金属离子结合(GO:0046872)和整体-[酰基载体蛋白]合成酶活性(GO:0008897)。表明超声波处理可能引起上述基因的差异表达调控，进而影响玉米种子活力相关性状的表达。

对Cluster 1和Cluster 2基因进行KEGG富集分析，选取富集分析结果中FDR值最小的前20绘制KEGG显著富集柱状图，富集结果分析显示，Cluster 1(图 9)主要注释在光合作用(ko 00195)、蛋白质外排(ko 03060)、类胡萝卜素的生物合成(ko 00906)、植物的昼夜节律(ko 04712)、谷胱甘肽代谢、(ko 00480)、卟啉和叶绿素代谢(ko 00860)、硫代谢(ko 00920)、光合作用-天线蛋白(ko 00196)、泛醌和其他萜类醌的生物合成(ko 00130)、次生代谢产物的生物合成(ko 01110)、植物激素信号转导(ko 04075)、脂肪酸伸长率(ko 00062)、精氨酸生物合成(ko 00220)等通路中。

Cluster 2(图 10)主要注释在苯丙素的生物合成(ko 00940)、次生代谢产物的生物合成(ko 01110)、类黄酮生物合成(ko 00941)、氰氨基酸代谢(ko 00460)、植物激素信号转导(ko 04075)、亚油酸代谢(ko 00591)、淀粉和蔗糖代谢(ko 00500)、二苯乙烯、二芳基庚烷和姜酚的生物合成(ko 00945)、代谢途径(ko 01100)、氮素代谢(ko 00910)、磷酸肌醇代谢(ko 00562)、抗坏血酸和海藻酸盐代谢(ko 00053)、不饱和脂肪酸的生物合成(ko 01040)和谷胱甘肽代谢(ko 00480)等通路中。

图4 Cluster1 GO注释分类 Fig.4 Cluster1 GO annotation classification

图5 Cluster2 GO注释分类Fig.5 Cluster2 GO annotation classification

图6 Cluster1 GO富集分析Fig.6 Cluster1 GO enrichment analysis

图7 Cluster2 GO富集分析Fig.7 Cluster2 GO enrichment analysis

对两个趋势基因集注释到的KEGG通路进行联合分析，发现共富集到34个通路(图 11)，分别为苯丙烷生物合成、次生代谢产物的生物合成、黄酮类生物合成、氰氨基酸代谢、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、代谢途径、氮素代谢、磷酸肌醇代谢、谷胱甘肽代谢、MAPK信号转导途径-植物、精氨酸生物合成、植物与病原体的相互作用、磷脂酰肌醇信号系统、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、醚脂质代谢、氨基酸的生物合成、泛醌和其他萜类醌的生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢、过氧化物酶体、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成、蛋白质出口、甘油磷脂代谢、半乳糖代谢、昼夜节律-植物、光和生物中的碳固定、乙醛酸和二羧酸酯代谢、甘油酯代谢、吞噬体、泛素介导的蛋白水解、碳代谢、内质网中的蛋白质加工。表明响应超声波处理的差异基因通过影响糯玉米自交系种子的上述通路来促进种子萌发，提高种子活力。

图9 Cluster1 KEGG富集分析Fig.9 Cluster1 KEGG enrichment analysis

图8 Cluster 1和Cluster 2共富集的GO termFig.8 GO term co-enriched by Cluster 1 and Cluster 2

3 讨论与结论

采用超声波处理玉米种子并对显著影响种子活力的处理进行转录组测序分析，该数据反映了经超声波处理后玉米种子萌发生长过程中基因差异表达情况，通过对差异基因的表达和功能分析，探索响应超声波处理后种子活力相关基因的表达调控，为超声波对玉米种子活力的影响以及其相关分子机制的研究提供一定的参考。本研究通过对糯玉米自交系N 51进行不同时长的超声波处理，发现超声波处理5 min、10 min和15 min的种子萌发率均高于未进行超声波处理，其中10 min和15 min差异达到显著水平，这与陈晓辉[13]和吴海燕[14]的研究结果相似，表明超声波处理可以提高玉米种子的活力。

转录组测序分析筛选得到两个与种子萌发率在不同处理中呈现出趋势一致的共表达模式基因集Cluster 1(857个基因)和Cluster 2(848个基因)。通过GO功能注释和共富集分析，得出Cluster 1和Cluster 2基因集注释到生物过程、分子功能和细胞组成三个大类的共92个亚类，分别富集在氧化还原过程、对氧化应激的反应、幼苗发育、对非生物刺激的反应、激素水平的调节、金属离子结合和整体-[酰基载体蛋白]合成酶活性这7个过程中。研究表明，植物激素在种子萌发过程中起到显著作用[28-29]，本研究结果与之相似。对Cluster 1和Cluster 2基因集进行KEGG富集分析表明，它们参与了与代谢、细胞过程、有机系统、遗传信息处理和环境信息处理相关的34条通路，其中与代谢相关的通路，如苯丙烷生物合成、次生代谢产物的生物合成、淀粉和蔗糖代谢、谷胱甘肽代谢、氨基酸的生物合成，已在小麦[30-31]和水稻[32]相关研究中表明与提高种子活力相关；与细胞相关的通路中的过氧化物酶体已在玉米[33]和拟南芥[34]中被证明可有效促进根的伸长和发育。这些与本研究中超声波处理促进种子活力表达所影响的主要通路结果一致，表明这些通路在调控种子活力方面发挥了重要的作用。本研究对超声波处理影响种子萌发时期的部分差异基因进行探索，而超声波处理对玉米苗期生长、抗逆能力、生产潜力等多方面影响的相关基因的表达与调控还需要进一步深入挖掘。

图10 Cluster2 KEGG富集分析Fig.10 Cluster2 KEGG enrichment analysis

图11 Cluster1和Cluster2共富集的通路 Fig.11 Cluster1 and Cluster2 co-enrichment pathways