DKK2 基因质粒的构建及其在敖汉细毛羊成纤维细胞中表达量的研究

王 雷，刘 猛，荣 恒，柳 楠，贺建宁*

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.临沂市兰山区畜牧发展促进中心，山东临沂 276600）

羊毛是毛用羊的主要产品之一，也是毛纺工业原料的主要来源。羊毛的产量和品质决定了毛用羊的经济价值，遗传和环境等因素影响着羊毛的生长，而遗传是决定羊毛产量和品质的基础。毛发产生于毛囊，毛囊的生长发育规律和结构特征影响着羊毛的性状，也是探究毛囊生长发育调控机制的基础。毛囊是能够自我再生的皮肤器官，其生长受一系列通路及基因的调控。研究表明Dickkopf 2（）基因在毛囊发育、毛发生长周期、组织器官胚胎发育、肿瘤等病变中有重要调控作用。

DKK 基因家族包含了，它们编码了由255～350 个氨基酸组成的分泌性糖蛋白，能与Wnt 配体竞争性结合受体LRP5/6 从而抑制与毛囊生长发育相关的经典Wnt/-catenin 信号通路。Wnt/-catenin 信号通路对毛囊的生长起重要作用，它可以调控毛囊形态发生和毛囊再生，对毛囊干细胞的增殖和分化有调控作用。有研究指出，Wnt/-catenin 通路可治疗脱发疾病，其机制源于Wnt/-catenin 刺激休眠期的毛囊从而致使毛发的再生。目前，有关在毛囊发育中表达生长周期的调控作用已初步探究，但有关和Wnt/-catenin 信号通路在调控毛囊发育和生长周期的相互作用关系和分子机制还研究较少。本研究将通过过表达基因，探讨对毛囊生长发育的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料 采集40 日龄敖汉细毛羊胎羊皮肤组织，实验羊来自青岛奥特种羊场。

1.2 试剂及仪器 Roche TRIZol 试剂、Roche 反转录试剂盒、TaKaRa 胶回收纯化试剂盒、TIANGEN pGM-T克隆载体、Omega 质粒抽提试剂盒、pcDNA3.1 质粒载体、l、l 限制性核酸内切酶，HyClone DMEM高糖培养基、gibco 胎牛血清、HyClone DPBS（磷酸缓冲液），以上试剂均购自青岛尚赛科贸有限公司。

1.3 质粒构建

1.3.1 引物设计 从绵羊组织中提取总RNA，并反转录为cDNA，参考Genbank 数据库中绵羊基因序列（登录号为ΧM_004009640.4），设计引物并进行CDS区全长的扩增。在上下游引物5' 端分别加入l、l 限制性内切酶的酶切位点及保护位点。基因的引物设计结果为：上游引物：5'-CTAGCTAGC TCCTCCTTCCCATTTGTATCCGTAT-3'；下游引物：5'-CGGGTACC CTTGTCCTCAGAGGTGGTCATATTT-3'。

PCR 体系为25 μL：cDNA 模板为1 μL（80 ng/μL），上下游引物各1 μL（10 μmol/L），Green Mix 22 μL。将PCR 产物进行1%浓度琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.2 TA 克隆 首先将PCR 产物纯化回收，并将回收后的产物与T 载体连接。pGM-T 载体连接体系：10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μL；T4 DNA Ligase（3 U/μL）2 μL：pGM-T 载体（50 ng/μL）DNA 片段5 μL；反应条件设置为25℃金属浴反应2 h，4℃过夜连接。

1.3.3基因与pcDNA3.1 载体连接 对TA 克隆载体及pcDNA3.1 质粒同时进行双酶切，酶切体系为：l 1 μL、l 1 μL、Buffer 1 μL、pGM-DKK2 10 μL、pcDNA3.1 10 μL、ddHO 28 μL，37℃水浴2 h，分别对基因和pcDNA3.1 载体双酶切产物进行胶回收纯化后连接。连接体系为：基因5 μL、pcDNA3.1 4 μL、T4 DNA 连接酶1 μL，T4 DNA 连接酶Buffer 1 μL；反应条件设置为：22℃金属浴反应2 h，16℃金属浴反应3 h，反应完成后立即转化大肠杆菌感受态细胞DH5，划线法接种于含氨苄青霉素的固体LB 培养基，37℃过夜培养，第2 天挑取单菌落并接种于液体LB 培养，150 r/min、37℃摇菌12 h，进行菌液PCR 鉴定，并将阳性组送至生工生物工程股份有限公司进行一代测序进一步鉴定，通过质粒提取试剂盒提取阳性质粒。

1.4 成纤维细胞的分离及培养 取40 日龄胎羊，彻底消毒后去除胎羊的头部和四肢，将躯干剪成1.5 mm 和2 mm 大小的组织块均匀分散放入培养皿中，胎牛血清（FBS）37℃预热5 min 加入培养皿中，置于37℃、5% 的CO培养箱中，培养4 h 后，加入完全培养基（DMEM+10% FBS+1% 双抗）继续培养，24 h 后再次更换完全培养基，定期在显微镜下观察细胞形态和生长情况。当原代细胞生长密度达到95% 时进行细胞传代培养，传代时吸出原培养液，用PBS 清洗3 次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化4 min，待细胞变圆，加入3倍体积的完全培养基终止消化，转移细胞至15 mL 离心管中，1 000 r/min 低速离心5 min，吹打混匀培养皿内的液体使之形成细胞悬液，按照1:3 的比例将重悬液平均分配到3 个培养瓶中，将培养瓶放入恒温培养箱中继续培养直至细胞汇合度达到90% 时，进行第2 次传代培养。

1.5 细胞瞬时转染 待汇合度达到90%进行转染。转染试剂为Lipofectamine 2000，其分别加入20 μL 的脂质体试剂和不含有双抗的480 μL 的DMEM，混匀后静置10 min，在实验组中加入40 μL 的重组质粒和460 μL 的DMEM（不含双抗），对照组加入500 μL 的DMEM，静置20 min，放入37℃培养箱内，6 h 后更换完全培养液再培养36 h。

1.6 转染细胞的定量检测 待实验组和对照组细胞汇合度达到90%，提取细胞总RNA 并反转录为cDNA，用PrimerPremier 5.0 软件针对敖汉细毛羊基因的CDS 区和绵羊基因的CDS 区进行引物设计，引物序列信息如表1 所示。

表1 引物信息基因

荧光定量PCR 反应程序为：95℃预变性7 min；95℃变性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸30 s，设置45 个循环。参考CT 值，用2法进行相对表达量计算。实验组和对照组分别设置3 个重复，用SPSS 17.0 软件进行差异显著性分析。

1.7 Western Blot 检测DKK2 蛋白表达量 将质粒转染后的细胞和未做质粒转染实验的细胞分别作为实验组及对照组，每组设置3 个平行样品。提取细胞总蛋白，以其为模板进行Western Blot，以-actin 作为内参蛋白。首先对提取的蛋白进行转膜，用5% 的BSA 进行蛋白封闭2 h，TBST 洗膜3 次，每次洗5 min；将一抗按1:2 000 的比例稀释，孵育1 h；用TBST 洗膜3 次，每次洗5 min，选择山羊抗兔的二抗进行1:2 000 的比例稀释，孵育1 h；用TBST 洗膜3 次，每次洗5 min，在暗室中进行曝光。

2 结果

2.1 RNA 提取 RNA 提取后，进行电泳检测，结果如图1 所示，得到3 条清晰的条带，从大到小依次为28 s、18 s、5 s，说明RNA 完整性较好，可用于后续实验。

图1 RNA 电泳鉴定

2.2基因PCR 扩增 如图2 所示，扩增产物大小为780 bp 且条带明亮无杂带，与已知的目的基因大小一致。

图2 DKK2 基因PCR 产物鉴定

2.3 TA 克隆 将T 载体与目的基因进行连接，目的基因片段为780 bp，T 载体大小为3 015 bp，目的基因连接到T 载体上大小在3 795 bp 处（图3），与已知大小基本相吻合并且条带单一无杂带，结果显示克隆载体构建成功，可用于后期的酶切实验。

图3 克隆载体的鉴定

2.4 TA 克隆测序比对 将克隆载体转化至大肠杆菌DH5中，震荡培养12 h，将菌液送至生工生物工程股份有限公司进行一代测序。如图4 所示，TA 克隆的过程中碱基没有发生突变，可进行下一步的表达载体构建。

图4 TA 克隆测序比对

2.5 TA 克隆载体、pcDNA3.1 表达载体双酶切 如图5所示，PGM-T-DKK2 载体经酶切后的片段为780 bp 和3 015 bp，与已知大小吻合，可用于构建重组质粒。

图5 克隆载体及pcDNA3.1 载体双酶切

2.6 表达载体pcDNA3.1 构建及鉴定 将目的基因与pcDNA3.1 分别切胶回收，连接后转化到大肠杆菌DH5中，37℃振荡培养12 h，对菌液进行PCR 反应后经电泳鉴定，条带在780 bp 处（图6），说明目的基因成功连接到pcDNA3.1 载体上。

图6 表达载体pcDNA3.1 的菌液PCR 鉴定

2.7 qRT-PCR 检测基因表达 以成纤维细胞cDNA为模板进行PCR 扩增，电泳结果如图7 所示，与预期片段大小一致，引物可用于荧光定量PCR 的扩增。

图7 内参基因GAPDH（A）目的基因DKK2 扩增产物(B)

荧光定量PCR 扩增曲线、熔解曲线如图8 所示。实验组与对照组目的基因相对表达量差异极显著（图9）。

图8 DKK2 和GAPDH 溶解曲线峰值图（A）和扩增曲线图（B）

图9 DKK2 基因mRNA 相对表达量

2.8 Western Blot 检测蛋白表达量 如图10 显示，实验组蛋白条带灰度明显高于对照组。Image J 软件进行蛋白条带分析，数据显示实验组的DKK2 蛋白表达量极显著高于对照组（图11）。

图10 DKK2 蛋白表达条带

图11 DKK2 蛋白相对表达量

3 讨 论

调节毛囊生长发育的信号分子主要分为Wnt 通路、BMP 通 路、NOTCH 通 路、TNF 家 族、FGF 家族、Shh 家族等。综合前人研究，Wnt 信号可以对正常机体的平衡进行维持，能够对细胞增殖、分化、凋亡等一系列生理过程产生影响，且Wnt 通路极为保守。和通过拮抗经典Wnt 信号通路在毛囊的初始发生、毛囊的密度中起负性调控作用。基因在物种间具有较高的保守性，在人、小鼠、牛、山羊和猪中CDS 序列都具有很高的相似性。Sick确定WNT 及其抑制剂DKK 是小鼠毛囊间距的主要决定因素。Song通过制备基因敲除鼠，使小鼠无毛区长出毛发。人的基因被认为是肠道干细胞的Notch 信号的靶标，在灵长类动物中创建或增强的Notch-DKK2 信号传导环与WNT-DKK1 和BMP-IHHSFRP1 信号传导环互补，可用于负调控经典WNT 信号传导通路。基因在癌症相关的研究较多，研究表明DKK2 能促进多种肿瘤发生。Sun研究发现miR-154 可以通过直接抑制基因以激活Wnt信号通路并增强了心脏成纤维细胞的活性。基因在经济动物上的研究较为少见。陶虎成功构建了牛Dkk2-pcDNA3.1 表达载体，通过转染CHO 细胞验证了其mRNA 及蛋白表达水平均显著上升。周佳伟等研究发现基因内的第2 内含子的一个新的SNP位点与猪的产活仔数显著相关。高建斌通过PCRSSCP 技术研究了秦川牛基因SNPs 与体尺性状和肉质性状之间的关联性。封竣淇等发现黔北麻羊基因和甲基化与生长性状的相关性。

本实验分离了敖汉细毛羊胚胎成纤维细胞，成功构建绵羊基因的pcDNA3.1 表达载体。成纤维细胞来源于中胚层，而中胚层一般在胚胎发育第5 周末形成。本实验选择40 日龄胎羊，细胞状态及活力较好，更有利于原代细胞的培养；且胎羊体积相对较小，便于操作。脱发目前仍是困扰人类的难题，探究调控毛发生长周期的分子机制尤为重要，细毛羊可以作为研究毛发生长分子机制的良好的动物模型。本实验可以作为研究DKK2 在细毛羊生长发育调控机制的基础，基因对细毛羊毛囊生长的调控还需要进一步验证。

4 结 论

本研究构建了pcDNA3.1-DKK2 过表达载体，通过转染敖汉细毛羊成纤维细胞，对绵羊基因进行过表达。荧光定量qPCR 结果表明，实验组基因表达量极显著高于对照组，Western Blot 结果显示实验组DKK2 蛋白表达量极显著高于对照组，进一步证明了基因过表达实验模型的建立。