周 爽 苏小珊 林国福 刘怡飞 高宏志
福建医科大学附属第二医院临床分子诊治研发中心,福建泉州 362000
肺癌对于当今世界来说,仍是一个严峻的挑战,在临床当中, 肺癌的发病率和病死率都高居癌症首位,而且已经呈现出逐年上升的趋势[1]。 巨囊性病液体蛋白-15(gross cystic disease fluid protein 15,GCDFP-15)又名泌乳素诱导蛋白(prolactin-inducible protein,PIP),是一个约17 kDa 的蛋白, 由许多正常的大泌腺细胞分泌,存在于精浆、唾液、泪液、眼泪、汗腺中。GCDFP-15 在乳腺癌中广泛表达, 作为该疾病的组织病理学诊断标志物[2-4]。 纯化的GCDFP-15 可促进乳腺癌细胞的生长[3]。除了细胞增殖,GCDFP-15 介导了乳腺癌细胞的侵袭, 这一过程部分依赖于其天冬氨酸蛋白酶活性[5]。
GCDFP-15 虽然是一个小蛋白,但其生物功能多样,已知其在免疫调节、生育力、抗菌活性、细胞凋亡和肿瘤进展中起着至关重要的作用。一方面它可与T 淋巴细胞、巨噬细胞和精子表面的CD4 受体结合[6]。另一方面,GCDFP-15 具有免疫调节功能,GCDFP-15缺乏的小鼠出现淋巴器官出现异常[7]。 GCDFP-15 与来自几个属的细菌结合,这表明这种糖蛋白也可能参与先天免疫和保护宿主免受微生物感染。 其次,GCDFP-15 具有天冬氨酸蛋白酶活性,可降解纤维连接蛋白,提示其在恶性肿瘤进展中的重要作用[3]。
在肿瘤研究中,GCDFP-15 乳腺癌和前列腺癌的增生和转移过程起作用[8-10],且在乳腺癌中的过表达与癌的预后有关。除了乳腺癌和前列腺癌,GCDFP-15在其他恶性肿瘤中也有异常的表达[11-13]。 GCDFP-15也被用于区分口腔、乳腺和结肠的原位肿瘤[14]。 研究显示,GCDFP-15 提示胰腺癌、 肝癌与乳腺癌的转移[3,13,15]。 免疫组织化学法显示GCDFP-15 在脑的腺癌和肺上皮癌也有过表达[8,16]。 此外,GCDFP-15 还被用于识别来源于乳腺癌的肺转移癌[3,8]。GCDFP-15 在圆锥角膜中的潜在治疗作用被确定[17-18]。 尽管如此,GCDFP-15 在乳腺癌以外的癌症中的作用研究较少,在肺癌中更少。早期研究GCDFP-15 在正常支气管黏膜下腺和支气管上皮中表达,而在肺癌中的作用和表达情况并不清楚。本研究旨在检测肺癌及正常对照组血浆中的GCDFP-15 蛋白水平以及肺癌细胞系、支气管上皮细胞系中的GCDFP-15 mRNA 和蛋白水平,探讨GCDFP-15 在肺癌中的作用。
选取2019年10月至2020年10月福建医科大学附属第二医院收治的54 例肺癌患者作为研究对象,其中男34 例(62.96%),女20 例(37.04%);年龄44~89 岁;鳞癌22 例(40.74%),腺癌32 例(59.26%)。纳入标准: ①患者经手术组织病理检验证实为肺癌;②患者对本研究知情同意并签署知情同意书。排除标准:①合并其他肿瘤或精神障碍者;②术前接受过局部放疗、全身化疗或其他抗肿瘤治疗者;③资料不完整者。本研究经福建医科大学附属第二医院伦理委员会审核批准。选取同期21 例体检健康者,其中男13例(61.90%),女8 例(38.10%),平均年龄(39.63±3.52)岁。纳入标准:①年龄18~55 岁的健康成年人;②无肿瘤或其他慢性病,2年内常规体检指标均正常者。 用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测所有受试者血浆中的GCDFP-15。
从上海细胞库购置5 株细胞系, 用于培养和检测。 细胞系信息见表1。
表1 细胞系信息
1.2.1 基于癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库分析肺癌中的泌乳素诱导蛋白的表达差异 从生物信息数据库TCGA 中的肿瘤大数据分析网站GEPIA 中查询GCDFP-15 在肺癌组织和癌旁组织中的表达(癌旁组织59 例,肺癌组织515 例),同时分析GCDFP-15 不同表达水平的肺癌患者的预后情况。 依据肺癌分型,对肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC) 分别查询GCDFP-15 在癌组织与癌旁组织中的表达差异。
1.2.2 ELISA 将入组的血浆样本50 μl 及试剂盒配备的标准品严格按照GCDFP-15 ELISA 试剂盒(上海江莱生物科技有限公司;货号:JL14570)说明书进行实验。 Thermo Scientific Multiskan Sky 全波长酶标仪检测450 nm 波长的OD 值,所得数据依照试剂盒说明书的方法在Curve Expert 1.4 中进行分析计算, 并用GraphPad Prism 7.0 进行数据可视化和统计学分析。
1.2.3 细胞系与培养 H1975、H520、H460、A549 以及16HBE 细胞在含有1%双抗、10%胎牛血清的DMEM培养液,37℃、5%CO2保持饱和湿度培养, 隔天换液,待细胞密度80%~90%时常规传代。
1.2.4 Western blot 各组6 孔细胞培养板中的细胞传代2 次后,收集对数生长期的细胞,用蛋白提取试剂盒(Solarbio Life Science;货号:BC3711)提取总蛋白, 提取的总蛋白经BCA 蛋白质定量试剂盒(Solarbio Life Science;货号:PC0020)测定其蛋白浓度, 取50 μg 总蛋白样品进行SDS-PAGE 分离蛋白质,电泳结束后转膜于PVDF 膜,经5%脱脂牛奶室温封阻2 h 后, 按抗体说明书的稀释比稀释一抗GCDFP15 (Abcam 公司; 货号:ab133290) 和内参α-Tubulin(Abcam 公司; 货号:ab7291),4℃摇动孵育过夜,加抗兔/鼠二抗,室温下摇动1.5 h,用1×TBST 缓冲液洗3 次,每次5 min,ECL 化学曝光显影。 将膜置于GE Image Quant LAS4000 mini 成像系统上扫描目的条带和内参条带,经Image J 系统分析GCDFP15 和内参α-Tubulin 蛋白表达量。
1.2.5 定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR) 提取细胞中的总RNA,用Thermo Scientific Multiskan Sky 全波长酶标仪测定浓度和纯度后备用。 根据逆转录试剂盒(Takara;货号:RR047A)说明书将总RNA 逆转录为cDNA。按照TB GreePremix Ex TaqTM试剂盒(Takara;货号:RR420A)说明书的操作步骤,通过ABI Quant Studio 5 PCR仪检测GCDFP-15 的mRNA 水 平。GCDFP-15 的正向引物为5′-TCAGGACAACACTCGGAAGA-3′,反向引物为5′-CGTCACATAGGCAGGCAGTA-3′,GAPDH 的正向引物为5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,反向引物为5′-AGGGGCCATCCAC-AGTCTTC-3′。 qPCR 反应体系包括1 μl cDNA样品、10 μl TB Green PCR Master Mix 和0.4 μl 正、反向引物。 反应循环条件谨遵TB GreenPremix Ex TaqTM试剂盒(Takara;货号:RR420A)说明书。 以GAPDH作为内参照, 采用2-ΔΔCT法分析GCDFP-15 mRNA 的表达。
采用GraphPad Prism 7.0 统计学软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t 检验,多组间比较采用方差分析;计数资料用率表示,两组间比较采用χ2检验,以P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1.1 LUAD 和LUSC 中肿瘤组织和癌旁组织的GCDFP-15 转录组水平的比较 TCGA 转录组学数据查询结果显示,在肺腺癌中,癌组织与癌旁组织的GCDFP-15 mRNA 比较,差异无统计学意义(P>0.05);肺鳞癌中,癌组织与癌旁组织的GCDFP-15 mRNA 比较,差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。
图1 LUAD 和LUSC 中肿瘤组织和癌旁组织的GCDFP-15 转录组水平的比较
2.1.2 LUAD 和LUSC 中不同临床分期患者肺癌组织中GCDFP-15 转录组水平的比较 LUSC 中,Ⅰ~Ⅲ期癌组织的GCDFP-15 mRNA 低于癌旁组织, 差异有统计学意义(P<0.05);Ⅳ期癌组织与癌旁组织的GCDFP-15 mRNA 比较,差异无统计学意义(P>0.05)。LUAD 中,Ⅲ期癌组织中的GCDFP-15 mRNA 与癌旁组织比较,差异无统计学意义(P>0.05);Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期癌组织的GCDFP-15 mRNA 均高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。
图2 LUAD 和LUSC 中不同临床分期患者肺癌组织中GCDFP-15转录组水平的比较
2.1.3 GCDFP-15 高表达肺癌组与GCDFP-15 低表达肺癌组生存期的比较 低表达组的中位生存期为109 个月,高表达组的中位生存期为90 个月,两组比较,差异无统计学意义(P=0.054)(图3)。
图3 GCDFP-15 高表达肺癌组与GCDFP-15 低表达肺癌组生存期的比较
经ELISA 检测血浆中GCDFP-15 的含量,54 例肺癌患者血浆中的GCDFP-15 含量为(62.12±7.159)ng/ml,高于21 例正常对照组的(42.27±4.21)ng/ml,差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。 鳞癌组和腺癌组的GCDFP-15 含量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
图4 ELISA 方法检测肺癌患者及正常对照组的血浆GCDFP-15含量
5 株细胞RT-qPCR 检测GCDFP-15 mRNA 的表达情况,结果如图5 所示,其中16HBE(人支气管上皮样细胞)未检测到GCDFP-15 mRNA,A549(人非小细胞肺癌细胞)、H520(人肺鳞癌细胞)的GCDFP-15 mRNA 含量高于H460(人大细胞肺癌细胞)、H1975(人肺腺癌细胞),差异有统计学意义(P<0.05)。4 株肺癌细胞株的GCDFP-15 mRNA 含量均高于16HBE,差异有统计学意义(P<0.05)。
图5 RT-qPCR 方法比较5 株细胞系中GCDFP-15 mRNA 的表达差异
收集5 株细胞, 采用Western blot 检测GCDFP-15 及内参tubulin 基因的表达,结果如图6 所示,7 次检测,均未能检测到特异性条带。
图6 Western blot 检测5 株细胞中GCDFP-15 蛋白的表达(重复7 次的结果)
收集5 株细胞的培养基上清,用ELISA 法检测其中GCDFP-15 蛋白的含量, 结果显示A549 和H460细胞培养基上清中的GCDFP-15 蛋白水平均高于16HBE,差异有统计学意义(P<0.05);H520、H1975 与16HBE 的GCDFP-15 蛋白水平比较, 差异无统计学意义(P>0.05)(图7)。
图7 ELISA 法检测5 株细胞系培养基上清中的GCDFP-15 蛋白含量
肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因,非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的85%, LUAD 和LUSC是最常见 的NSCLC 类 型。GCDFP-15 在乳腺的病理状态和一些外分泌组织中表达,如泪腺、唾液腺和汗腺[19]。 其在抗菌、免疫调节及肿瘤进程中均发挥着重要的生物学作用[20]。 研究发现GCDFP-15 在乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中出现过表达现象,且提示GCDFP-15 与肿瘤转移浸润也有关系[2]。
GCDFP-15 在肺癌中的研究十分有限。Osawa 等[19]利用序列特异性引物对多种组织进行RT-qPCR 检测,发现GCDFP-15 基因在脑、肺、肝、脾、心脏、骨骼肌、肾、胃、子宫和卵巢中的表达可以忽略不计。 另一方面,它在泪腺、腮腺、舌下、颌下腺、乳腺和精囊中大量表达。 免疫组织化学分析显示GCDFP-15 在脑腺癌[9]和肺腺癌[21]中过表达。
本研究为明确GCDFP-15 在肺癌中的表达情况,首先利用TCGA 数据库分析,发现LUAD 和LUSC 中的GCDFP-15 的表达趋势不同,GCDFP-15 低表达组显示出比高表达组更高的中位生存期,这是肺癌组织标本的结果,血浆样本的结果可能不同。 应用ELISA方法检测肺癌患者及正常对照组的血浆GCDFP-15含量, 发现肺癌组的GCDFP-15 含量高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。 但是通过血浆提取GCDFP-15 mRNA 得到的是阴性的结果,这很可能是因为该蛋白属于分泌型,mRNA 并未被转运到细胞外。文献报道称人和啮齿动物的GCDFP-15 基因在外分泌器官中表达,并通过分泌囊将GCDFP-15 转移到这些器官的液体分泌物中[20]。因此mRNA 在血浆中本身就几乎不存在,无法被检测到。
本研究利用4 株肺癌细胞和1 株支气管上皮细胞系进行实验,分别以RT-qPCR 和Western blot 技术检测细胞中的GCDFP-15 mRNA 和蛋白水平,结果发现4 株肺癌细胞中的GCDFP-15 mRNA 均高于支气管上皮细胞系, 且不同的肺癌细胞系之间也有差异。但是Western blot 却得到了阴性的结果,GCDFP-15为特异性囊肿病液体蛋白15,分泌型,分子量约17 kDa,抗体说明书检测条带介于15~20 kDa, 检测难度大。考虑该蛋白分泌至培养基里,本研究尝试使用ELISA检测培养基上清中的GCDFP-15 蛋白,得到的结果均为阳性,但是由于培养基内含有胎牛血清,胎牛血清本身是否含有GCDFP-15,值得考量,经文献调研和血清厂家的咨询, 均无确凿的证据表明血清中自带GCDFP-15,后续实验可以考虑用无/低血清培养基进行培养,或设置一个放置培养箱中但不铺细胞的空培养基作为对照组来消除血清干扰的问题。 另外,不同细胞系的大小、生长速度不尽相同,除了控制铺板时的细胞数,对于检测GCDFP-15 前的细胞密度不便于统计,所以,在培养基上中检测GCDFP-15 如何精准定量是个值得思考的问题。后续实验将从三个方面入手进行优化,以期得到更精准有效的结果:首先,扩大入组样本量; 其次, 增加肺癌患者的唾液样本进行GCDFP-15 检测;最后,在细胞水平的实验中,努力优化条件(如无血清培养等),力争更科学、有效地检测培养基上清液中的GCDFP-15 蛋白。
综上所述,本研究利用TCGA 数据库对肺癌组织中的GCDFP-15 转录组进行分析,发现GCDFP-15 低表达组显示出比高表达组更高的中位生存期;结合肺癌患者血浆标本以及肺癌细胞系的检测结果,初步确定GCDFP-15 在肺癌患者血浆中呈现特异性表达升高的趋势,提示GCDFP-15 可能是肺癌外周血中的肿瘤标志物,但此次研究样本量偏小,结论需得到临床更大样本量的验证。