张丽美 刘云平 邱 丽 刘 瑾 钟晓玲▲
1.深圳市中医院妇科,广东深圳 518033;2.深圳市中医院超声科,广东深圳 518033;3.深圳市中医院生殖健康科,广东深圳 518033
宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)临床表现为经量过少、闭经腹痛、不孕或反复胚胎丢失等[1]。 宫腔手术的女性继发IUA 的占比为25%~30%[2]。 西医治疗IUA 通常采用宫腔镜下IUA 分离术及口服雌孕激素等方法,但中重度IUA 仍有一定的复发率[3]。 近年来, 许多文献均报道,IUA 术后中西医结合治疗可明显降低其IUA 复发率,且已有学者对该类文献中核心处方进行数据挖掘[4-5],但对中医药防治IUA 的具体机制及作用靶点仍不明确。 本研究选取治疗IUA 的高频中药作为研究对象,通过网络药理学方法对其防治IUA 的作用机制进行进一步解析, 期望能为临证配伍和进一步实验研究提供参考。
本研究以“宫腔粘连”“数据挖掘”或“组方规律”或“用药规律”或“处方分析”作为检索词,收集建库至2021年6月公开发表在中国知网、维普网、中国生物医学文献数据库有关中医药治疗IUA 的数据挖掘类文献。 全文均有明确的药物累计频次信息,统计文献中高频次中药。
从文献研究中获得治疗IUA 的高频中药,设置生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性(drug likeness,DL)≥0.18 为筛选条件,运用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinse Medicine Systerms Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)筛选高频中药的全部化学成分及靶点蛋白,将去重后的药物靶点蛋白导入通用蛋白数据库Uniprot(https://www.uniprot.org)中,获得高频中药对应的人源基因靶点名称。
以“intrauterine adhesion”作为检索词,通过人类基因数据库GeneCards(https://www.genecards.org/)获得IUA 疾病靶点,作为IUA 疾病基因数据库。将药物、药物有效成分及疾病基因导入Cytoscape 3.7.2 软件中将其关系可视化。
通过Venny2.1 软件获得药物与疾病的交集靶点,将其输入STRING 数据库(https://string-db.org/),来源设置为“Homo sapiens”,选择minimum required interaction score 为high confidence 0.9,并勾选hide disconnected nodes in the network,获取高频中药治疗IUA 潜在作用靶点的蛋白互作网络(protein-protein interaction,PPI),将结果导入Cytoscape 中进行可视化显示。同时在该软件的CytoNVA 插件中筛选核心靶标, 网络拓扑分析筛选条件为:degree centrality(DC)、betweenness centrality(BC)、closeness centrality(CC)均大于中位数。
通过网络拓扑分析获得的核心靶标导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp),种属和背景选择 “Homo sapiens”, 分别进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析及基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG) 通路富集分析,两者均设定P<0.01,错误发现率(false discovery rate,FDR)<0.01 作为筛选条件。 其中GO 富集内容包括:生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、细胞组分(cellular component,CC)三个内容,GO 富集分析结果采用R4.1.0 软件输出直方图,KEGG 分析以气泡图形式体现。
利用PDB 数据库(https://www.rcsb.org/)下载Degree 值排列前3 位的核心靶点的3D 蛋白结构文件,设置以下选择条件:①Homo sapiens 来源;②分辨率≤2.5 A;③小分子配体信息详细,蛋白结构完整;④pH 值在人体正常生理范围;⑤通过X-ray 方法解析。 将筛选后的蛋白结构通过PyMol 2.3.0 软件进行预处理。 通过TCMSP 数据库下载Degree 值排名前3位的化学成分结构文件。 将处理后核心蛋白结构和小分子结构导入Autodock 1.5.6 软件进行分子对接。
检索得到2 篇中医药治疗IUA 的数据挖掘类文献[4-5],分别统计两篇文献中排名靠前的高频次中药,结果见表1。 结果显示,两者的共同高频中药是当归、熟地黄、川芎、桃仁、红花、牛膝,后文将以此作为研究对象。
表1 治疗IUA 中药复方中的药物频次统计
将高频中药当归、熟地黄、川芎、桃仁、红花、牛膝分别作为检索词,运用TCMSP 数据库获得全部化学成分, 去重并去除无对应靶点成分后共纳入50 个药物活性化学成分,结果见表2。
表2 高频中药化学成分信息表
通过GeneCards 数据库获取IUA 疾病靶点共3743 个。将“2.2”项下纳入的50 个药物化学活性成分导入Uniprot 数据库中,去重后获得202 个人源基因靶点名称。 运用Venny 软件选取交集,得到147 个高频中药治疗IUA 的潜在作用靶点,结果见图1。
图1 药物-疾病潜在作用靶点
将数据导入Cytoscape 软件中将其关系可视化。结果显示, 按照Dgree 值排列前3 位的是豆甾醇、山奈酚、槲皮素,三者分别是高频中药治疗IUA 的主要活性成分(图2)。
图2 药物-有效成分-疾病靶点网络图
将交集基因输入STRING 数据库, 得到药物-疾病的PPI 网络,结果见图3,包括138 个节点、492 条相互作用线,平均节点度为7.13,平均局部聚类系数为0.423。
图3 高频中药治疗IUA 的PPI 网络图
采用CytoNCA 插件筛选核心靶标, 其中各项中位数为:DC=5、BC=61.968、CC=0.174,共获得64 个核心靶点。 按DC 排名前3 位的基因靶点是:TP53、STAT3、MAPK1, 提示这些靶点在高频中药治疗IUA中尤为重要。 排名前5 位核心靶点结果见表3。
表3 按DC 排名前5 位的网络拓扑分析结果
将核心靶点导入DAVID 数据库,结果显示:BP92条,MF 22 条,CC 12 条,主要涉及凋亡过程、细胞增殖调控、药物反应等生物过程,胞质、核浆、细胞外区域等细胞结构以及蛋白结合、酶结合、转录因子结合等分子功能, 筛选排名前10 位的GO 富集进行可视化处理,结果见图4。
图4 排名前10 位GO 富集分析直方图
核心靶点导入数据库共获得117 条富集通路,筛选后有83 条信号通路符合条件。 分析提示核心靶点与T 细胞受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、Toll 样受体信号通路等有关, 运用微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn)对筛选后的前30 条KEGG 通路结果进行可视化处理,见图5。
图5 核心靶点的KEGG 信号通路分析(前30 位)
利用Autodock 软件将主要成分豆甾醇、山奈酚、槲皮素与排名前3 位的核心靶点TP53、STAT3、MAPK1 进行分子对接,结果见表4,结果显示,相互间的结合能均<-5.0 kcal/mol,提示核心靶点与化学成分间的对接均有较好的结合能力。并将结合活性强烈的豆甾醇与MAPK1 组输入PyMol 软件进行可视化,结果见图6。
图6 豆甾醇与MAPK1 分子对接结果
表4 不同核心靶点与化学成分分子对接的结合能(kcal/mol)
肾虚血瘀为IUA 最主要病机[6],数据挖掘类文献统计出中医学者治疗IUA 时选取当归、 熟地黄、川芎、桃仁、红花、牛膝等药物的用药频次高,与肾虚血瘀病机相呼应。 其中,位居首位的当归为补血要药,同时具有行血之效,熟地黄为“至阴之药”,善于滋补肝肾阴血;两者互用补而不滞。 川芎、桃仁、红花、牛膝为血府逐瘀汤的重要组成部分, 该方为治疗血瘀证的经典名方,除心脑血管疾病外,妇科疾病的应用亦颇多[7],且活血类中药具有促进血管新生、改善血液流变学、促进内膜局部血液循环、阻止粘连再次发生的效果[8-9]。 现代中医学者选取此类中药防治IUA,临床疗效十分满意[10]。
中药配伍后防治IUA 的具体作用机制不明,本研究利用网络药理学发现高频中药治疗IUA 的有效成分主要是豆甾醇、山柰酚、槲皮素等,三者主要涉及炎症-免疫反应、细胞周期调控。豆甾醇可明显抑制白介素(interleukin,IL)-1、IL-6 等以达到抗炎作用,且可下调相关信号通路起到抑制肿瘤的作用[11]。 山柰酚可抑制蛋白激酶活性,影响细胞增殖周期[12]。 槲皮素是最有效的抗氧化剂,可穿过细胞膜发挥抗炎及抑制细胞周期的作用[13]。 主要化学成分与TP53、STAT3、MAPK1 等靶点基因的关系尤为密切, 且通过分子对接验证主要化学成分与前三者均有较好的结合能力。 其中TP53 可促进DNA 修复、使细胞周期停顿或凋亡[14],STAT3 可促进促血管生成的关键调节信号的生成,介导细胞的生长、凋亡等过程[15]。激活MAPK 家族可促进子宫内膜上皮细胞增殖,改善子宫内膜容受性[16-17]。 核心靶点基因亦涉及炎症反应、细胞周期调控,与高频中药的主要化学成分药效不谋而合。 而目前IUA 的治疗方法中, 除了物理隔离外, 包括干细胞、透明质酸钠的宫腔注射及血管扩张剂、雌激素的口服应用等均可促进内膜细胞增殖分化、 抑制内膜局部炎症的作用[18]。 通过GO 富集分析可预测,这些核心靶标主要在胞质、核浆、细胞外区域等位置发挥作用,并通过药物反应、凋亡过程、细胞增殖调控等生物过程发挥蛋白结合、酶结合、转录因子结合等分子功能。
KEGG 富集分析发现,高频中药治疗IUA 可能通过上述核心靶标诱导下游转录因子,激活T 细胞受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、Toll 样受体信号通路等发挥作用。 其中T 细胞受体信号通路、Toll 样受体信号通路均为炎症-免疫反应通路,Toll 样受体信号通路不仅参与炎症反应,对内源性损伤模式分子亦有识别作用,参与非特异性免疫[19]。 PI3K-Akt 信号通路生理状态下表达低下,当细胞损伤后,会迅速激活促进细胞增殖[20]。
综上所述, 现代中医学者防治IUA 选取的高频中药可能通过调控内膜细胞周期、 局部炎症-免疫调节等生物环节起到预防IUA 复发的作用。 本研究为中医药治疗IUA 临证选药及实验提供数据支持,但本研究同时存在一定不足, 如未对文献质量进行评价、文献中临床药方有限,研究样本量少,尚处于理论层面, 对高频中药治疗IUA 的作用机制仍需开展实验研究加以证实。