三七总皂苷-TCP骨修复复合材料的生物相容性评价*

康 乐 陈 萍 陈仲华 区文欢 司徒坚 刘 彦 廖志鹏

广东省江门市五邑中医院 暨南大学附属江门中医院 529000

临床上由于外部创伤和并发感染等原因引发的骨缺损、骨不连和延迟愈合等问题给患者带来较大不便，其治疗也是骨科医生面对的棘手问题[1]。目前，骨移植材料主要来自自体骨、同种异体骨以及异种骨三种材料，但三种材料均存在一定程度的缺点，在应用上颇为受限[2]，近年来，随着再生组织工程学技术的发展，基于生物材料为载体的骨组织工程修复技术取得长足进步，本研究前期成功制备了一类新型的载药仿生骨修复支架材料，主要由成骨诱导因子三七总皂苷与磷酸三钙(TCP)生物涂层组合形成，TCP材料克服了以往由聚乳酸、壳聚糖代表的高分子材料所具有的力学性能较低，以及羟基磷狄石陶瓷等为陶瓷韧性较差等缺点[3]，同时三七总皂苷主要来源于中药三七，现代药理学结果显示，三七总皂苷可促进成骨细胞增殖，同时增强骨折缺血组织供血能力，进而促进愈合[4]。基于此，为了深入研究三七总皂苷-TCP骨修复复合材料在临床应用的可行性，本研究通过体外实验，从细胞增殖速度、生化指标和细胞形态等多方面探讨材料的生物相容性。

1 材料与方法

1.1 实验材料 6月龄山羊1只(上海甲干生物科技有限公司)，胎牛血清，DMEM培养基，胰蛋白酶，青霉素—链霉素(美国Gibco公司)；噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司)，骨钙素和碱性磷酸酶ELISA检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，三七总皂苷(西安百川生物科技公司)，S-3000N 扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)，CKX41倒置相差显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 三七总皂苷-TCP骨修复复合材料制备。将三七总皂苷溶于无水乙醇。随后在30%的Na2HPO4溶液中400℃条件下浸泡10h，去离子水冲洗10min，真空干燥，随后将三七总皂苷无水乙醇溶液与Na2HPO4·12H2O(23.75g/L)和Ca(NO3)2(18.2g/L)溶液中70℃条件下作用48h，用4%NaOH 去离子水饱和浸泡三七总皂苷8h，随后用去离子反复清洗饱和三七总皂苷溶液至中性，冷冻干燥得到三七总皂苷-TCP复合材料。按照此方法制备载药量分别为200、100、50、25、12.5μg/ml的三七总皂苷-TCP复合材料，对照组仅采用单纯TCP，不加入三七总皂苷，亦不用含饱和三七总皂苷的溶剂浸洗。

1.2.2 山羊骨髓间充质干细胞的分离和培养。取6月龄山羊1只，采用戊巴比妥钠麻醉，应用16号骨穿针行髂骨穿刺，吸取骨髓5ml，加等量含10%胎牛血清的DMEM培养基，2 000r/min离心5min，吸除上层脂肪层，随后移取至100cm2培养瓶，培养5d至细胞贴壁后更换培养基，待生长至对数生长期进行传代，取第2代细胞分别经碱性磷酸酶和油红O染色鉴定为骨髓间充质干细胞后进行后续实验。

1.2.3 扫描电镜。三七总皂苷-TCP骨修复复合材料约4mm×3mm大小，经干燥后表面喷金，S-3000N扫描电子显微镜观察其表面形态。

1.2.4 MTT增殖实验检测细胞增殖。取消毒过的三七总皂苷-TCP骨修复复合材料1.5g，眼科剪剪成碎末状，置于成软骨诱导培养基含40ng/ml地塞米松，10ng/ml转化生长因子β1，100ng/ml胰岛素样生长因子-1；无血清培养，用20μm微孔滤膜过滤，加胎牛血清1.5ml，分别配成含200、100、50、25、12.5μg/ml材料浸提液。山羊BMSCs细胞接种至24孔板，待细胞贴壁，加入100μl材料浸提液继续培养，每孔分别于第1、3、5、7天四个时间点加入20μl MTT溶液，离心弃液，加入DMSO 150μl，振荡混匀5min，用酶标仪在570/630nm处测定吸光度(A)。

1.2.5 ELISA检测骨钙素和碱性磷酸酶含量。取经不同浓度材料处理过并已培养7d的山羊BMSCs细胞，1 000r/min离心10min，去上清，PBS漂洗3遍，离心去上清，参照试剂盒说明测定细胞碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)含量。

2 结果

2.1 不同载药量三七总皂苷-TCP复合材料的扫描电镜观察 仿生构建的三七总皂苷-TCP复合材料孔隙率适宜，孔隙相互联通，孔径均匀一致，均约为150μm，此空间结构适合细胞生长；载三七总皂苷剂量大小对TCP复合材料的结构无明显影响，结构相似。详见图1。

a b c

2.2 三七总皂苷-TCP复合材料对细胞增殖影响 山羊 BMSCs在三七总皂苷-TCP复合材料浸提液中正常生长，增殖良好，5个浓度组与对照组的增殖率存在显著性差异(P<0.05)。随着三七总皂苷-TCP浸提液浓度的增大，山羊BMSCs的增殖率越高，并呈时间—剂量依赖效应(P<0.05)。详见表1。

表1 三七总皂苷-TCP复合材料对细胞增殖率影响

2.3 三七总皂苷-TCP复合材料对ALP和OCN的影响 随着三七总皂苷含药浓度增高，ALP和OCN含量依次明显增加，呈现剂量效应(P<0.05)，详见表2。

表2 三七总皂苷-TCP复合材料对ALP和OCN影响

3 讨论

现代药理学研究结果表明三七总皂苷可诱导体外条件培养的间充质细胞向成骨细胞分化，具有促进骨折愈合的功效[5]。因此，三七总皂苷作为种骨诱导活性因子为用于骨组织工程研究提供了理论基础。

随着仿生学的发展，模拟新骨生长过程的复合材料逐渐得到应用，现有研究表明，TCP材料具有疏松多孔的表层，为植入体内的骨长入提供了良好的物理结构，同时生物相容性较好，可在体内诱导骨生成，促进愈合，目前已在骨修复领域中得到广泛应用[6]。近年来，基于生物材料联合成骨诱导活性因子的骨修复策略愈发受到关注。根据本研究前期细胞学实验结果，最大载药量可达200mg，其对材料的孔隙结构不发生显著干扰，因此本研究制备了载5种不同剂量的三七总皂苷-TCP复合材料，同时采用的最大载药量为200mg，电镜扫描的载药材料的结果显示，载药剂量对材料的密度、孔隙率和孔径的影响甚小，因此可以判断不高于200mg的载药量对三七总皂苷-TCP材料的空间结构不会造成实质影响。从细胞相容性来看，采用材料浸提液培养第二代山羊骨髓间充质干细胞7d，单纯TCP材料未抑制细胞增殖，表明该材料本身具有较高的安全性；载三七总皂苷材料明显促进骨髓间充质干细胞的增殖，且具有时间和剂量效应，其原因主要是三七总皂苷的骨诱导活性因子发挥作用，可促进骨细胞增殖和分化，同时由于TCP材料成分主要是无机钙，其随着时间的延长逐渐降解，在细胞局部形成高钙环境，为期增殖提供钙源，从而促进成骨细胞增殖以及分化成熟，因此，三七总皂苷-TCP复合材料可协同促进细胞增殖，增进骨愈合。碱性磷酸酶可直接反映成骨细胞的活性或功能状况，是反映成骨细胞活性和数量的专一标志物，是目前最常用的评价骨形成和骨转换的指标[7]。骨钙素又称骨R-羟基谷氨酸蛋，在调节骨钙代谢中起重要作用，能够参与人体骨骼的新陈代谢，是研究骨代谢的一项新的生化标志物[8]。本研究结果显示碱性磷酸酶和骨钙素的含量具有剂量效应关系，也可进一步证实细胞增殖旺盛，促进向骨细胞分化，综上来看，三七总皂苷-TCP复合材料同时可协同发挥促进成骨细胞增殖、分化和成熟[9]。

综上所述，通过原位复合技术可构建出具有三维空间结构和要求的三七总皂苷-TCP复合材料，该材料生物相容性良好，为下一步开展的体内成骨实验研究提供依据。