Nrf2/HO-1信号通路在帕潘立酮治疗精神分裂症大鼠中的作用

王莉 张凇 龙威 (齐齐哈尔医学院精神卫生专业，黑龙江 齐齐哈尔 161003)

精神分裂症(SZ)临床症状主要表现为思维、情感和行为等方面障碍，SZ发病率和致残率非常高〔1〕，目前，SZ确切的发病机制还不清楚。地卓西平马来酸盐(MK-801)为非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，通过拮抗NMDA受体模拟SZ阳性与阴性症状〔2〕。研究表明采用MK-801可使自发性活动增加、社会交往、感觉运动及学习记忆功能等缺陷发生〔3,4〕。抗精神病药物能逆转MK-801诱导的上述异常行为〔5,6〕。帕潘立酮是新型非典型的抗精神病类药物，用于急慢性SZ治疗，有效降低SZ复发率，不良反应少〔7,8〕。目前，帕潘立酮抗SZ及神经元保护机制尚不明确。转录因子NF-E2相关因子(Nrf)2是十分重要的核转录因子，被激活时能进入细胞核，结合抗氧化反应元件，启动抗氧化物的转录以对抗氧化应激损伤〔9〕。血红素氧合酶(HO)-1是Nrf2重要的下游靶分子，催化血红素降解成为胆绿素、一氧化碳(CO)和铁等酶解产物，并发挥较强抗氧化、抗炎作用〔10〕。本研究通过探讨帕潘立酮治疗MK-801诱导的SZ小鼠疗效及Nrf2/HO-1信号通路的参与作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级，50只健康SD大鼠，体重180～220 g，购自浙江省实验动物中心，许可证号：SCXK(浙)20080033。适应性饲养7 d后，开展实验，所有动物在实验过程中自由饮食。

1.1.2药物与主要试剂 MK-801、利培酮、帕潘立酮(Sigma)；MK-801溶于生理盐水中，配成浓度为2 mg/ml，置于-70℃中保存备用。将帕潘立酮溶解于1 μl/ml的冰乙酸双蒸水中，使用1 mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液(索莱宝)将其pH调至6.0，分别配成浓度为0.03、0.30 mg/ml的溶液，现用现配；一抗：酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、Nrf2、HO-1、二抗(美国Abcam)。

1.2方法

1.2.1动物分组及模型构建 将50只SD大鼠饲养于室温条件下，不限制其进食、饮水，适应性喂养2～3 d后采用MK-801进行诱导构建SZ小鼠模型〔11〕。将其随机分成5组：对照组(Control组)、SZ组(Model组)、利培酮组、低剂量帕潘立酮组和高剂量帕潘立酮组，每组8只，其余10只用于补充其他各组死亡的大鼠。Control组及Model组给予等量的生理盐水，低剂量帕潘立酮组、高剂量帕潘立酮组和利培酮组的大鼠分别给予帕潘立酮(0.03 mg/kg，1次/d)、帕潘立酮(0.30 mg/kg，1次/d)和利培酮(0.10 mg/kg，1次/d)，采用灌胃进行治疗。2次/d，持续给药15 d后对大鼠进行行为学测试。

1.2.2自发活动 采用43.2 cm×43.2 cm×30.5 cm 规格的有机玻璃旷场试验测试箱对大鼠进行分析，并在试验箱周围配备红外线网络跟踪监测系统〔12〕。暗光线、安静的房间内进行本实验，该测试系统记录大鼠10 min内的自由活动情况及位置信息，并采用数据采集和分析处理系统模拟大鼠整个活动轨迹，并分析大鼠总活动距离。实验结束后，使用70%的酒精清洗实验箱，晾干。

1.2.3水迷宫实验 水迷宫实验测试大鼠参考记忆，其主要由圆形水池(半径为60 cm)和平台组成，其水深30 cm，将水迷宫池等分为4个象限区域，分别记为NE、SE、SW、NW，平台直径为6 m，高14 cm。将水温保持在(23±1)℃，在整个实验过程中，迷宫周围一切标志保持不变〔13〕。正式实验开始之前，将大鼠放入水迷宫中，熟悉约1 min，开始正式训练，将大鼠以面向池壁的方式随机从4个入水点放入水中，记录大鼠从入水到水下平台的时间，即逃避潜伏期；4次/d，间隔30 min，连续4 d进行训练，从第5天开始测试并记录大鼠逃避潜伏期；之后撤除水下平台，进行空间探索实验并记录大鼠1 min内穿越平台的总次数。

1.2.4社会交往 采用有机玻璃材质的社会交往测试箱对大鼠社会交往进行测试，实验开始前，将大鼠进行2 d隔离，每天在社会交往测试箱中适应约10 min，第3天将大鼠进行两两配对，每对体重差≤20 g，将配对后的大鼠放入箱中测试15 min，用相机记录并分析〔14〕。评价指标为社会交往时间与非攻击性行为百分比，非攻击性行为百分比=〔非攻击性行为时间/(非攻击性行为时间+攻击性行为时间)×100%〕。

1.2.5Western印迹检测大鼠海马组织中酶切caspase-3、Bax、Nrf2和HO-1蛋白表达水平 将大鼠海马组织置于冰水浴中进行匀浆，根据总蛋白提取试剂盒说明书对大鼠海马组织中的总蛋白进行提取，之后采用二喹啉甲酸(BCA)法对蛋白浓度进行测定。将各组50 μg的蛋白样品进行上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，之后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。再采用5%的脱脂牛奶封闭2 h。然后，分别加入一抗酶切caspase-3(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Nrf2(1∶600)、HO-1(1∶500)在4℃下过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2～3次，之后与二抗进行孵育，室温反应1 h，之后在避光条件下采用TPBS进行洗膜，以β-actin作为参照，最后使用凝胶成像系统分析条带的相对密度值，并通过酶切caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1与β-actin的比值表示其表达水平。

1.3统计学方法 采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1帕潘立酮对SZ大鼠自发活动的影响 与Control组自发活动总距离〔(24 981.62±4 052.83)cm〕相比，Model组〔(98 345.60±9 036.25)cm〕显著升高(P<0.05)；与Model组自发活动总距离相比，利培酮组、低剂量帕潘立酮组、高剂量帕潘立酮组〔(40 713.05±3 814.57)、(77 349.56±3 964.58)、(47 453.56±9 823.52)cm〕均显著降低(P<0.05)；与利培酮组相比，低、高剂量帕潘立酮组自发活动总距离显著升高(P<0.05)。表明帕潘立酮可减少SZ大鼠总活动距离。

2.2帕潘立酮对SZ大鼠学习记忆的影响 与Control组相比，Model组逃避潜伏期显著升高，穿越平台次数显著减少(P<0.05)；与Model组相比，利培酮组、低剂量帕潘立酮组与高剂量帕潘立酮组逃避潜伏期显著降低，穿越平台次数显著增多(P<0.05)；与利培酮组相比，低、高剂量帕潘立酮组逃避潜伏期均显著升高，穿越平台次数均显著减少(P<0.05)。见表1。表明帕潘立酮能提高逃避潜伏期，降低穿越平台次数。

表1 不同处理大鼠水迷宫成绩比较

2.3帕潘立酮对SZ大鼠社会交往能力的影响 与Control组相比，Model组大鼠社会交往时间和非攻击性行为百分比均显著降低(P<0.05)；与Model组相比，利培酮组、低剂量帕潘立酮组、高剂量帕潘立酮组社会交往时间和非攻击性行为百分比均显著升高(P<0.05)；与低剂量帕潘立酮组相比，高剂量帕潘立酮组社会交往时间和非攻击性行为百分比均显著升高(P<0.05)。见表2。表明帕潘立酮可提高SZ大鼠的社会交往时间和非攻击性行为百分比。

表2 不同处理大鼠社会交往能力的比较

2.4帕潘立酮对SZ大鼠海马组织中细胞凋亡相关蛋白表达的影响 与Control组相比，Model组海马组织中酶切caspase-3和Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与Model组相比，利培酮组、低剂量帕潘立酮组、高剂量帕潘立酮组酶切caspase-3和Bax蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)；与低剂量帕潘立酮组相比，高剂量帕潘立酮组caspase-3和Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图1、表3。表明帕潘立酮可抑制海马组织酶切caspase-3和Bax蛋白的表达。

1～5：Control组，Model组，利培酮组，低剂量帕潘立酮组,高剂量帕潘立酮组，下图同图1 各组大鼠海马组织酶切caspase-3和Bax的比较

表3 各组大鼠海马组织酶切caspase-3、Bax、Nrf2和HO-1蛋白表达水平

2.5帕潘立酮对SZ大鼠海马组织中Nrf2、HO-1蛋白表达的影响 与Control组相比，Model组海马组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与Model组相比，利培酮组、低剂量帕潘立酮组、高剂量帕潘立酮组Nrf2和HO-1蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)；与低剂量帕潘立酮组相比，高剂量帕潘立酮组Nrf2和HO-1显著升高(P<0.05)。见表3、图2。表明帕潘立酮可通过调控Nrf2/HO-1通路治疗大鼠SZ。

图2 各组Nrf2、HO-1蛋白表达的比较

3 讨 论

SZ已经严重威胁到人类的生命健康，其发病率呈现逐年上升趋势〔10〕。研究表明MK-801可诱导SZ样行为学改变〔11〕，研究表明抗精神病类药物能够逆转MK-801所诱导的大鼠自发性活动〔12〕。本研究结果表明通过帕潘立酮治疗可逆转SZ大鼠自发活动，对SZ模型大鼠有一定治疗效果。

SZ主要表现为认知缺陷，注射小剂量MK-801会损害大鼠记忆，说明MK-801诱导的SZ模型鼠模拟SZ患者的认知功能缺陷〔15〕。研究报道腹腔注射小剂量的MK-801可导致成年后大鼠空间学习记忆能力受损〔16〕。与上述研究结果一致，本研究结果表明MK-801诱导的SZ模型鼠空间学习记忆功能受损；帕潘立酮对MK-801所诱导的SZ模型大鼠的空间学习记忆损害有一定逆转作用，且逆转效应与治疗剂量相关。

研究表明，NMDA能诱导成年大鼠的社交性功能缺陷〔15〕。本研究结果表明经MK-801诱导可导致成年大鼠社交性功能缺陷。研究表明，帕潘立酮可改善SZ患者的社会功能缺陷〔17〕。本研究结果表明帕潘立酮能改善经MK-801所诱导的SZ大鼠社交性功能缺陷，其治疗作用与给药剂量呈现一定相关性。

Nrf2是一种重要的抗氧化转录因子，当机体受到不利条件刺激时，在细胞质中，Nrf2从Keap-1中解离，活化后进入核内，对抗氧化反应元件进行识别，启动下游HO-1及超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化基因的转录〔18〕。在体内，HO-1有抗氧化与细胞保护作用，激活Nrf2能起到神经保护作用〔19〕，在转基因动物脑内，Nrf2通路表达降低〔11〕。在淀粉样前体蛋白(APP)/早老素基因(PS)1转基因鼠体内敲除Nrf2基因可使大鼠认知损害显著增加〔18〕。本研究结果表明上述通路蛋白在帕潘立酮治疗SZ大鼠症状过程中具有一定的调节作用。