针刺对SAMP8小鼠神经干细胞活性、STAT3蛋白水平的影响及作用机制

王煜 赵岚 阚伯红 史慧妍 贾玉洁

(天津中医药大学第一附属医院 1针灸科，天津 300193；2针灸研究所)

我国脑部疾病的发病率逐年攀升，严重的脑部疾病常表现为神经细胞明显凋亡〔1〕，日常生活中以认知障碍、语言功能障碍等为主要特征〔2〕。减少神经细胞凋亡并且通过一定医疗手段促进神经元功能恢复对治疗脑部疾病有一定效果。常规药物治疗副作用较大，不宜长期进行〔3，4〕。针刺主要通过抑制神经过度兴奋反应，减少神经细胞凋亡等来改善患者情况。近年来，神经干细胞(NSCs)移植治疗脑部疾病获得了一定进展，但对于针刺是否能促进神经细胞分化还需进一步研究。NSCs存在于胚胎细胞及哺乳动物中枢神经系统中，是一种具有多种分化潜能的细胞。NSCs具有多种分化功能如自我更新的能力，产生多种细胞如星形胶质细胞及神经元等〔5〕，调控并参与神经系统的多种功能并对大脑结构起决定性作用。信号转导与转录激活因子(STAT)3对细胞生长、分化等生命过程具有调节作用，在胚胎干细胞上起主要调节作用，过多会引起NSCs增殖受到抑制，氨基酸残基磷酸化促进其激活，转化为磷酸化(p)-STAT3，调节NSCs增殖〔6，7〕，本研究探讨针刺对NSCs活性及STAT3蛋白水平的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 60只小鼠购于同济大学实验动物中心。其中SAMP8小鼠40只(针刺组和SAMP8组各20只)；SAMR1小鼠20只(SAMR1组)，鼠龄在8 w左右，饲养室温为24℃左右，体重在25～30 g，自由活动包括进食与饮水(纯净水)，在无压环境下让60只小鼠自由生活适应1 w新环境。

1.2实验药物与器材 STAT3抗体(武汉菲恩生物有限公司)、溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)一抗(沈阳万类有限公司)、钙结合蛋白(S100β)抗体(杭州联科生物有限公司)、性别决定相关基因簇(SOX)-2抗体(艾美捷科技有限公司)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(上海玉博有限公司)。

1.3方法

1.3.1针刺干预 针刺组选取百会、血海、肾俞、膈俞、百会向后平刺3～5 mm，血海、肾俞直刺2～3 mm，膈俞以80°角斜向上刺2～3 mm。进针后，血海、膈俞施捻转泻法，施针幅度180～360°，频率50～60次/min；肾俞、百会施捻转补法，施针幅度60～90°，频率120～150次/min，运针1 min，留针10 min。SAMP8组及SAMR1组小鼠给予同等程度的捉抓刺激，时间相同。每日1次，连续48 d。

1.3.2Morris水迷宫实验(学习能力检测) 对所有小鼠连续干预48 d后，对所有小鼠进行为期4 d的水迷宫实验，检测小鼠学习能力，将小鼠从不同象限面向池壁放入水中，记录小鼠从入水到找到平台并爬向平台的时间和路程，若小鼠超过120 s还未能找到平台，用木棍指引其游上平台并停留20 s，进行下一次训练，记录分别记录水迷宫实验1～4 d小鼠逃避潜伏期时间。

1.3.3脑组织取材 免疫荧光染色：处死前1 d腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，8 h/次，共3次。戊巴比妥钠60 mg/kg腹腔注射麻醉，40 g/L荧光示踪灌注固定液(CAS)灌注固定大脑，整脑取出后在40 g/L CAS中浸泡过夜。取整块脑组织，常规脱水、透明、石蜡包埋和连续冠状切片。

1.3.4苏木素-伊红(HE)染色 腹腔注射麻醉断头处死大鼠，将取出的双侧海马利用甲醛溶液固定，乙醇溶液脱水，石蜡包埋后切4 μm片，封闭处理应用山羊血清进行，苏木素和伊红染色液复染分别为6～8 min和10 s，于显微镜下观察SAMP1组、SAMP8组、针刺组海马区组织结构改变情况。

1.3.5免疫荧光检测BrdU阳性细胞数 取脑组织切片置于2 mol/L HCl中进行DNA变性处理，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，滴加BrdU一抗和S100β一抗，室温孵育60 min。冲洗后，加入带荧光二抗室温孵育 50 min。BrdU/小胶质细胞标志物(Iba-1)双标实验方法与以上步骤相同。SOX-2和GFAP染色采用自由漂洗荧光双染色法检测，冰冻切片与SOX-2抗体和GFAP在Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)中4℃过夜孵育，体积分数3%驴血清封闭。组织切片清洗后，带荧光二抗孵育2 h。采用共聚焦显微镜计数至少50个BrdU阳性细胞并确定细胞表型。

1.3.6TUNEL法检测细胞凋亡 将脑组织放入4%的CAS中固定、保存。石蜡包埋、切片、脱蜡、脱水；用蛋白酶K孵育。滴加50 μl的TUNEL反应混合溶液、孵育，加入50 μl转化剂-植物过氧化物酶(POD)进行信号转化和分析。加入二胺基联苯胺(DAB)底物溶液，苏木素复染细胞核，在光镜下分析图像。

1.3.7Western印迹检测STAT3及其磷酸化蛋白表达 取大鼠海马组织，加入裂解液和蛋白酶抑制剂，充分研磨，离心取上清液，蛋白定量。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转移至磷酸纤维素(NC)膜上，脱脂奶粉封闭1 h。加入STAT3、p-STAT3和β-actin抗体孵育过夜，洗片，辣根过氧化物酶(HPR)标记的二抗孵育1 h，洗片，显色，暗室曝光，显影，定影，按照说明进行操作。

1.4统计学分析 采用SPSS23.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.13组BrdU阳性细胞数比较 在不同染色指标下，3组的阳性细胞数目均有显著差异(P<0.05)，BrdU/S100β双标染色下，针刺组相比于SAMP8组阳性细胞数目明显增加，但与SAMR1组对比均明显减少(均P<0.05)；BrdU/Iba-1双标染色下，针刺组相比于SAMP8组阳性细胞数目明显增加，但与SAMR1组对比明显减少(均P<0.05)；SOX-2/GFAP双标染色下，针刺组相比于SAMP8组及SAMR1组阳性细胞数目均明显增加(P<0.05)。见图1、表1。

图1 3组不同染色指标阳性细胞数(×400)

表1 3组海马区阳性细胞数及STAT3、p-STAT3蛋白表达比较

2.23组HE染色结果 SAMP1组海马组织中神经元完整，有少量坏死，排列整齐；SAMP8组海马组织中出现大量的坏死神经元、细胞质及核内染色较浅且出现固缩、组织排列紊乱，针刺组与SAMP8组相比有明显改善，见图2。

图2 3组海马组织HE染色(×400)

2.33组神经元细胞凋亡比较 SAMR1组海马组织神经元细胞凋亡率〔(6.45±0.72)%〕最低，SAMP8组〔(21.78±3.17)%〕和针刺组神经元凋亡〔(13.56±1.43)%〕明显高于SAMR1组(均P<0.05);与针刺组相比，SAMP8组神经元凋亡升高明显(P<0.05)，见图3。

箭头所指深棕色为凋亡神经元细胞图3 3组海马区神经细胞凋亡(DAB，×400)

2.43组逃避潜伏期比较 3组逃避潜伏期均随着天数的增多而逐渐缩短，时间比较存在显著差异(P<0.001)；不同时间点中，与SAMR1组比较，SAMP8组逃避潜伏期显著延长(P<0.05)；与SAMP8组比较，针刺组逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)，组间与时间存在交互作用，见表2。

表2 3组小鼠逃避潜伏期比较

2.53组STAT3、p-STAT3蛋白表达比较 SAMR1组海马组织中STAT3、p-STAT3蛋白表达量与SAMP8组、针刺组相比明显降低(P<0.05)；与SAMP8组相比，针刺组STAT3、p-STAT3表达量明显下降(P<0.05)，见表1、图4。

图4 3组STAT3、p-STAT3蛋白表达情况

3 讨 论

针刺作为具有悠远发展历史的传统医学对多种疾病的治愈起到了桥梁作用，配合其他药物辅助疗法，对脑损伤及一些心脑血管疾病的防御与治疗有一定的积极意义。对不同的穴位行针刺处理并持续一段时间后能提高机体免疫力与代谢功能，对血管起修复作用的同时增加血流量，对于心脑血管的预防有积极作用。NSCs作为具有多种分化潜能的细胞〔8〕，其主要分布在大脑的皮层、和海马等重要部位，且处于静止状态。神经元凋亡的发生可能与NSCs损伤有关，研究证实其损伤会引起星形胶质细胞过度增生〔9〕。本文以BrdU标记检测NSCs再生现象，结果表明针刺对SAMP8小鼠NSCs的分化、再生有一定积极意义。BrdU可参与到细胞的合成，是一种胸腺嘧啶类似物。BrdU阳性细胞数表示分裂细胞，因此其阳性数目大小对定义NSC增生程度具有一定的间接作用〔10〕。高蕙兰等〔11〕通过动物实验研究发现，给予脑缺血再灌注大鼠2 w电针刺激干预后，与模型组相比，电针刺激后脑缺血再灌注大鼠神经功能有所改善，BrdU和双肾上腺皮质激素(DCX)阳性细胞表达升高，说明针刺对于脑缺血再灌注损伤具有保护作用，且作用机制与促进BrdU表达使得神经细胞再生有直接关系。目前针刺对于脑部疾病应用较为广泛，针刺对于神经系统具有保护作用，可增加大脑血流量，促进脑组织修复，同时针刺可以减少神经元细胞凋亡，抑制其损伤〔12〕。

针刺通过对穴位进行刺激，可改善老年痴呆小鼠的记忆，且相对安全。Morris水迷宫实验近年来已逐渐成熟，因其简单易操作被作为检测动物空间学习记忆功能的重要实验方法之一〔13〕。高音来等〔14〕通过对血管性痴呆大鼠进行研究发现，调心通督法针刺组大鼠相对于模型组及西药组大鼠，其学习能力更优，其作用机制与促进海马成纤维细胞生长因子(BFGF)表达有一定的关联性。有研究认为电针能够改善脑部疾病，通过对损伤脑组织细胞进行修复，提高缺氧脑组织细胞分泌，增加脑部神经营养生长因子表达，从而提高学习及认知能力〔15〕。这与本文研究结果相似。

STAT3在脑部疾病患者中往往呈现高表达。STAT3蛋白调节着不同的细胞生命过程，在细胞生长过程中起着重要作用，控制细胞的分化及凋亡等，STAT3蛋白在胚胎干细胞更新，氨基酸残基的磷酸化促进其激活，磷酸化后进入胞核内与靶基因结合，促进其转录，转化为p-STAT3蛋白后通过下游的靶基因调节神经干细胞的增殖〔16〕。研究表明，STATs蛋白家族广泛参与细胞增殖、凋亡及免疫调节等过程，其作用机制与调控Fas、Fas-L、Bcl-2信号通路有关〔17〕。在脑缺血再灌注损伤过程中，神经细胞凋亡逐渐增加，原因可能为酪氨酸蛋白激酶(JAK)-STAT3通路的激活能够抑制抗凋亡因子的作用，从而使患者情况恶化。p-JAK2、STAT3蛋白在脑损伤部位表达较正常部位有所增强，并促进神经细胞死亡，而JAK/STAT3信号传导通路使星形胶质细胞活化，影响其增殖分化的同时影响神经功能恢复〔18,19〕。孔莹等〔20〕研究发现针刺百会穴能够提高大鼠神经功能缺损评分，针刺大鼠可抑制其脑组织STAT3及其磷酸化的表达水平，从而对脑出血大鼠脑组织起到保护作用。STAT3与神经元凋亡及NSCs的增殖有一定的关系，并且针刺能够对STAT3产生一定的抑制作用，但其具体作用机制仍需进一步研究〔21〕。

综上所述，针刺能够促进SAMP8小鼠神经元的增殖分化并抑制STAT3蛋白表达，对于改善SAMP8小鼠行为能力有一定的积极意义。