环氧透明质酸改性脱细胞猪真皮基质的亲水保湿性研究

丁壮 ，黄轩涛 ，但年华 ，2＊

（1.四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室，四川 成都 610065; 2.四川大学制革清洁技术国家工程实验室，四川 成都 610065）

前言

1962 年，George D.Winter 通过对幼猪体皮肤的研究，首先发现并证明创伤口处湿性环境的优势，并且提出了“湿性愈合理论”[1]。1974 年出现了全球首块半透性的创口用敷料，进一步挑战了传统的干性伤口愈合理念。临床应用表明，湿性愈合不仅可以有效地减少慢性伤口恢复所需的愈合时间，还大大减少了换药的频率，避免换药痛苦和二次机械性损伤，增加伤者治疗满意度，缩短了创面愈合时间和伤者的住院时间。常见的湿性愈合敷料主要包括薄膜类、水凝胶类、水胶体（清创胶）类等[2-5]，它们由高分子有机物聚合而成，亲水保湿性能较好，但存在机械性能差、生物活性低等缺点。pADM 是保留了胶原纤维支架，去除猪皮中的表皮和真皮层细胞成分而得到的材料，具有优良的力学性能和生物相容性，已广泛用作真皮的替代物。但是 pADM 存在容易干燥、翘边的缺点，普通物理浸泡或者化学 改性的方法对 pADM 进行处理，往往会导致亲水性降低，或者亲水性能提高有限、保湿能力不足，仍然不能很好地满足湿性愈合环境的需要[6-9]。

HA 是由 D- 葡糖醛酸（GlcA）和 N- 乙酰氨基葡糖（GlcNAc）以双糖单位交替连接而成的直链高分子酸性黏多糖。因结构中含有大量的羟基和羧基，其螺旋柱形结构中内侧的羟基赋予了其优良的亲水性能，可以吸收自身重量的 1000 倍的水[10]，被公认为自然界中最强的天然保湿物质。在水溶液中，HA 链彼此缠结，通过氢键的作用将水分子固定于三维网状结构中[11-12]，使其较难流失，具有优异的“锁水”保湿功能，因而在化妆品、生物医学等领域有着广泛的应用[10]。

将 HA 的锁水保湿功能嫁接到 pADM 中，有望获得具有优良亲水保湿功能的 pADM 敷料。若仅用HA 浸渍 pADM，虽然可以提高其亲水保湿性能，但由于两者之间缺少牢固的化学键结合，经过水洗等处理后，会造成 HA 流失，保湿性能仍然不足。尽管采用高碘酸钠氧化 HA 得到的双醛透明质酸（OHA）也可以与 pADM 形成强烈的共价结合而将 HA 引入到 pADM 中，但是由于该氧化反应会造成糖环的破坏，甚至导致 HA 分子链断裂降解[13-14]，使其保湿性能大打折扣。因此，如何在不破坏 HA 糖环基本结构的前提下，将 HA 与 pADM 产生强烈的共价结合，使 HA 锚定于 pADM，是解决该问题的关键。

由于环氧基中电荷的极化和环张力的存在，使得环氧基具有极高的反应活性。它易与含有活泼氢原子的基团（如胺基、酚羟基、羧基、巯基、羟基、酰胺基等）发生反应，是一种常用的接枝改性试剂[15-19]。我们通过在 HA 糖环上引入环氧基的方法，赋予 HA 化学反应活性，得到新型交联改性剂EHA，然后再与 pADM 交联改性，希望能够达到理想的亲水保湿效果，见图 1。

图1 EHA 交联改性 pADM 的反应机制Fig.1 Preparation scheme of EHA-pADM

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

脱细胞猪真皮基质，医用级，江阴奔 翔 生 物 科技有限公司；透明质酸，环氧氯丙烷，1,4- 二氧六环，氢氧化钠，碳酸氢钠，碳酸钠，氯化铵，分析级，成都市科隆化工试剂厂；环氧透明质酸钠，自制。

1.2 实验仪器

FA1004 精密分析天平，上海精密科学仪器厂；Freeze 6 真空冷冻干燥机，美国 Labconco；HZS—HA水浴振荡器，哈尔滨市东明医疗仪器厂；ZKYY 恒温水浴锅，上海大研仪器有限公司；DSA-X 接触角测量仪，广州贝拓有限公司；204F1 差式扫描量热仪（DSC），德国 Netzsch 公司；SPM-9600 原子力显微镜（AFM），日本岛津公司；MAGNA IR560 傅里叶红外 光 谱 仪 （ATR-FTIR）， 美 国 Nicolet 公 司 ；MSW-YD4 数字式皮革收缩温度测定仪，陕西科技大学阳光电子研究所。

1.3 实验内容和方法

1.3.1 EHA-pADM 的制备

准确称取 1 g 的 pADM，加入到 pH 为 10.4 的NaHCO3-Na2CO3缓冲液中，分别加入 pADM 质量分数 2%、4%、8%的 EHA，在 37 ℃条件下恒温水浴振荡 72 h，水洗 3 次，再加入一定量的 NH4Cl 中和，再水洗 3 次；冷冻干燥，得到 EHA-pADM，按顺序分别记为 0%、2%、4%、8%。

1.3.2 EHA-pADM 结构分析

1.3.2.1 EHA-pADM 的 ATR-FTIR 检测

将样品进行 ATR-FTIR 的检测和分析。扫描波数为 4000～500 cm-1，分辨率为 4 cm-1，扫描重复 32次。温度 25 ℃，相对湿度为 65%。

1.3.2.2 EHA-pADM 的 AFM 观察

用冷冻切片机将样品平切为 9 μm 厚度的片状，将制备的片状样品平铺在盖玻片表面，使用AFM 观察样品表面的微观结构。

1.3.3 EHA-pADM 热稳定性能检测

EHA-pADM 的收缩温度检测和 DSC 检测；将材料剪成 1 cm×7 cm 的长方形条状样品，固定在收缩温度测定仪的试样钩上，在初始温度为 25 ℃、加热速率为 4 ℃/min 的条件下水浴加热，至数字显示屏上出现收缩温度为止，平行测定四个样品，结果取平均值；称取质量为 3～5 mg 的样品置于 DSC 坩埚中，通过 DSC 对样 品进行测定，温度范围为25～150 ℃，升温速率为 10 ℃/min，氮气保护气流为60 mL/min。

1.3.4 EHA-pADM 亲水性能分析

1.3.4.1 EHA-pADM 的接触角检测

采用坐滴法，以 20 μL 蒸馏水的液滴，滴在材料表面上，利用接触角测量仪记录液滴与材料表面接触的瞬间图像，利用软件检测其接触角，平行测定 5 次结果取其平均值。

1.3.4.2 EHA-pADM 的吸湿率与保水率检测

将材料制成 4 cm×7 cm 大小，在 20 ℃、RH 为33%条件下调节 24 h，使材料回潮率达到平衡。根据文献[8]对样品进行吸湿率与保水率测定。

1.3.5 EHA-pADM 的吸湿动力学分析

将盛有饱和 Na2SO4水溶液（RH=93%）的干燥器置于 20 ℃恒温环境中，精确称取一定量 EHA-pADM 干燥样品置于干燥器内，每隔 2 h 精确称取各样品质量，由放置前后样品的质量差，求出样品吸水量 Q。其中以 48 h 的含水量作为平衡含水量 qe，最后进行拟一级和拟二级吸附动力学进行分析。

2 结果与讨论

2.1 EHA-pADM 结构分析

2.1.1 EHA-pADM 的 ATR-FTIR 分析

pADM 的主要成分为 I 型胶原，天然的 I 型胶原具有特殊的三股螺旋结构，胶原蛋白分子与其它小分子化合物相互作用前后，胶原蛋白的特征吸收谱带会发生相应的改变。如图 2 所示，从红外光谱的特征酰胺吸收峰可以观察到，胶原分子的酰胺 A带的吸收峰位于 3410 cm-1，酰胺 I 带的吸收峰位于1650 cm-1处，酰胺 II 带的吸收峰位于 1545 cm-1处，酰胺 III 带的吸收峰位于 1235 cm-1，其中胶原特殊的三股螺旋结构与酰胺吸收峰相关[20]。对比不同EHA 用量的 EHA-pADM 的 ATR-FTIR 曲线图，其典型的吸收峰带并未产生太大变化。表明 EHA 改性不会对胶原分子结构造成破坏，pADM 在改性后仍保 持 着 胶 原分子的天 然 构 象 。EHA-pADM 在1080 cm-1处的吸收峰的峰形变尖且有一定程度的增强，这是由于 EHA 中的糖苷键的引入产生的吸收峰增强，说明 EHA 糖单元接枝到了 pADM 中。

图2 不同用量 EHA-pADM 的 ATR-FTIR 曲线Fig.2 ATR-FTIR spectra of EHA-pADM with different dosages of EHA

2.1.2 EHA-pADM 的 AFM 观察

pADM 中含有的天然四分之一错列模型构想使其具备较为优异的生物学活性，在 AFM 下观察不同改性剂用量的 EHA-pADM 样品的胶原纤维纵向分布。如图 3 所示，不同改性剂用量的 EHA-pADM样品的胶原纤维排列紧密，且可以观察到特有的、周期性的明暗横纹间距，表明其三股螺旋结构未被破坏，均保持胶原天然的构象，该结果与 ATR-FTIR结果 一致 ，EHA-pADM 有 望 继 承 pADM 优 良 的 生物学活性[21-22]。

图3 不同用量 EHA-pADM 的 AFM 图Fig.3 AFM images of EHA-pADM with different dosages of EHA

2.2 EHA-pADM 稳定性分析

良好的稳定性能够保证生物材料在使用过程中避免由于挤压、拉伸、降解以及其他问题而造成材料的损坏，其中湿热收缩温度、热变性 温度和热分解温度，可以从侧面反应材料的稳定性能。加热会使胶原分子间或分子内作用力降低，胶原纤维结构失去稳定性，胶原在不断加热的水中开始剧烈收缩的温度为胶原的湿热收缩温度（Ts）。如图 4 所示，交联改性后的 pADM 样品的收缩温度明显高于未交联的 pADM，其中总体趋势是随着改性剂的用量的增加，pADM 样品的收缩温度也随之升高，在 4%用量时 Ts 趋于恒定。其原因可能是胶原分子上的氨基等活性基团数量是一定的，当改性剂用量增加到一定程 度（4%）后 ，胶原上的活 性 位 点 基本被消耗，此时的交联程度最大，收缩温度趋于恒定。

图4 不同用量 EHA-pADM 的收缩温度Fig.4 Shrinkage temperature of EHA-pADM with different dosages of EHA

DSC 能够对物质的热稳定性进行研究。随着温度的上升，pADM 胶原分子中的弱级键 （如氢键，范德华力等）先断裂，温度继续上升，胶原的三股螺旋结构将会被破坏，由三股螺旋结构转变为无规则卷曲，最后变成三条 α 肽链，此时的温度即为 pADM的热变性温度[23]。图 5 为不同用量 EHA EHA-pADM的 DSC 曲线，EHA-pADM 的热变性温度 明 显 高 于pADM，表明 EHA 与 pADM 产生了 交 联 效 应。当EHA 用量不断增 加 时 ，EHA-pADM 的热 变 性 温 度也随之增高，说明随着 EHA 用量不断增加，EHA 与pADM 交联反应程度越强，这与之前收缩温度的结果基本对应。

图5 不同用量 EHA-pADM 的 DSC 图Fig.5 DSC curves of EHA-pADM with different dosages of EHA

2.3 EHA-pADM 的亲水性能分析

2.3.1 EHA-pADM 的接触角结果分析

材料表面接触角是表征材料表面亲水性能的一项重要指标。如图 6 所示，EHA-pADM 的接触角随着 EHA 用量的增大依次降低，说明 EHA 的用量越多，材料表面亲水性越好。这是因为，EHA 含有很多亲水基团（如羟基、羧基等）接枝到 pADM 上后，使其亲水基团数量大大增加。此外，环氧基与氨基反应还可以产生新的羟基，势必进一步在 pADM 表面形成强亲水层。这些极性亲水基团极易与水形成氢键等结合，使 pADM 的表面张力大大降低，表面亲水性越强。

图6 不同用量 EHA-pADM 的表面接触角Fig.6 Surface contact angles of EHA-pADM with different dosages of EHA

2.3.2 EHA-pADM 的吸湿率和保水率结果分析

如图 7 所示，改性后的 EHA-pADM 的吸湿率和保水率基本随着 EHA 用量的增加而提高。众所周知，HA 具有优异的吸水性和保水性。由图1的交联改性反应理可知，EHA 接枝到 pADM 后，仍然保持了完整的 HA 主链结构。一方面，将 HA 上的亲水基团引入到了 pADM 中，降低了表面张力。另一方面，更重要的是，HA 完整的糖环和链式结构这种高分 子“ 线团 ”结 构能够任意伸缩 ，分子能够 自由舒展，可以最大程度地结合溶液中的水分，形成一个三维立体网状结构，形成独特的“锁水结构”，使单个 HA 分子的锁水能力可高达 6×103mL/g[10]。当这些 HA 通过化学反应锚定于胶原纤维表面时，就可以结合尽可能的水分，发挥其锁水功效。由于氢键的作用以及形成的特殊的网络结构，吸收的水分子被牢牢地“锁定”在这三维网状结构之中，这些水分子将成为结合水，在一般外力作用下不易流失[12]，表现为优良保湿性能，从而实现 pADM 保湿锁水的功能。此外，当 EHA-pADM 与水接触后，水充盈于其微观孔隙结构中，在 HA 分子的加持下，获得更好的“固定”效果。因此，HA 的引入，使 pADM 的吸湿率和保水性能都有了明显的提高。根据湿性愈合理论，敷料亲水和保湿性能对细胞的增殖及创口的愈合的能力将有望增强[1]。

图7 不同用量 EHA-pADM 的吸湿率和保水率Fig.7 Moisture absorption rates and water retention rates of EHA-pADM with different dosages of EHA

2.4 EHA-pADM 吸湿动力学分析

如图 8a 所示，不同用量改性的 EHA-pADM 材料的含水量随着时间的增长而增加，前期（＜4 h）增加速率很快，然后随时间的延长而逐渐变慢，到 16 h 时基本趋于平衡。改性后的 pADM 的 吸水 量 明显高于未改性的 pADM，其中改性剂 EHA 用量为8%的 pADM 的平衡吸水量最大，EHA 用量为 0%的pADM 的平衡吸水量最小。

先采用一级吸附动力学方程拟合整个吸湿实验过程。Lagen gren 的一级吸附动力学方程表达式如下：

其中：qe和 q 分别为吸附平衡和时间 t 时刻的吸附量（mg/g），K1 是一次速率常数（min-1）[24]。如图8b 所示，以 log(qe-q)对 t 做线性关系，图中一级方程式拟合曲线求出各参数的值列于表 2 中，其线性 关系不佳（R2＜0.9）。因此转而使用二级吸附动力学方程拟合整个吸湿实验过程。二级吸附动力学方程表达式如下：

其中 K2是一次速率常数（g/mg·min-1）[24]。如图8c 所示，以 t /q 对 t 做线性关系，其具有良好的线性关系（R2＞0.99）。图中二级方程式拟合曲线求出各参数的值列于表2中，从表2中，可以发现计算的qe/cal 值 与 实 际 值 qe/exp 比 较 接 近 。 可 见 ，EHA-pADM 吸湿过程符合二级吸附过程，表明其吸湿过程不是单层分子层吸附，而是有多个水分子在同一个活性基团发生多层吸附。我们认为，由于 EHA-pADM 中含有大量的极性基团，在吸附初期，这些极性基团与水之间在氢键作用下，吸附到极性基团上，此后，形成的吸附层进一步将多个水分子锁住，从而形成多层吸附。当 EHA-pADM 与水（或体液）接触后，可能发生类似的过程。同时，由于前述的“锁水作用”，当将其用作伤口敷料时，可以长时间维持伤口处于湿润状态，避免干性结痂。根据Winter 的湿性愈合理论，细胞在 这 种湿润的环境中能够快速的繁殖、生长，这将有利于促进伤口愈合。

图8 吸湿动力学分析a. EHA-pADM 的含水量与吸附时间的关系 b. 一级吸附方程拟合的吸湿过程 c. 二级吸附方程拟合的吸湿过程（RH=93%）Fig.8 Hygroscopic dynamics analysisa.Relationship between water content of EHA-pADM and adsorption time b.First-order moisture-adsorption kinetic curves of EHA-pADMc.Second-order moisture-adsorption kinetic curves of EHA-pADM（RH=93%）

表1 一级吸附方程拟合曲线参数（RH=93%）Tab.1 First-order adsorption equation fitting curve parameters of EHA-pADM（RH=93%）

表2 二级吸附方程拟合曲线参数（RH=93%）Tab. 2 Second-order adsorption equation fitting curve parameters of EHA-pADM（RH=93%）

3 结论

采用新型改性剂环氧化透明质酸（EHA）改性pADM，得到的 EHA-pADM，结构更加稳定，并保持了 pADM 的基本微观结构。由于完整 HA 链的引入，增加的羧基、羟基等极性基团，有利于形成氢键引导的多层吸附，形成亲水结构，使材料的接触角明显下降；同时由于 HA 高分子“线团”吸水后形成的特殊网络结构，能够产生强烈的“锁水”作用，进而 使 EHA-pADM 的 保 湿 性 能 明 显 增 强 。 EHA-pADM 用作敷料覆盖伤口时，有助于形成局部的湿润环境，符合湿性愈合理论的要求，它有望成为一种新型的亲水保湿生物医用敷料。