升降散治疗急性胰腺炎并发多器官功能障碍机制研究

代晓玉，吴秋葶，姚佳琦，李 娟，万美华，唐文富

(四川大学华西医院，四川 成都 610041)

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是临床上常见的危急重症[1-2]。当患者出现多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)时，其病死率将提高到20%～30%[3]。因此，防治AP并发MODS是改善患者预后的关键。失控且不断放大的炎症反应是AP的重要发病机制[4-5]。有文献指出，升降散能够抑制炎症反应以保护AP患者[6]，但升降散进入体内后发挥作用的具体机制和作用靶点并不清楚。色氨酸-犬尿氨酸代谢通路是AP发病的重要炎症信号通路之一，通过给予犬尿氨酸-3-单加氧酶抑制剂GSK180可有效调节该通路并保护AP大鼠模型[7]。因此，本研究通过观察升降散对AP的治疗效果和对色氨酸-犬尿氨酸代谢通路的调节作用，旨在探讨其治疗效果及潜在的作用机制和靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 24只C57雄性小鼠，体重为(20±5)g，购于四川大学实验动物中心[合格证号：0011537；许可证号：SCXK(川)2018-026]。该实验方案通过四川大学华西医院伦理和动物伦理委员会的认可(方案编号：2020231A)。实验开始前，小鼠在四川大学华西科技园动物房适应性饲养1周。

1.2 实验药品及相关试剂 雨蛙素、脂多糖、犬尿氨酸(Kynurenine,KYN)、犬尿喹啉酸(Kynurenic acid,KYNA)、3-羟基犬尿氨酸(3-Hydroxy-DL-kynurenine，3-HK)均购于SIGMA公司(中国上海)。色氨酸(L-Tryptophan，TRP)、5-羟色胺(Serotonin hydrochloride,5-HT)于上海安谱实验科技股份有限公司购买。犬尿氨酸-3-单加氧酶(Kynurenine 3-monooxygenase,KMO)抑制剂GSK180 (CAS:817194-38-0)购于Selleck公司(中国上海)。甲醇(批号：185366)由Fisher Scientific公司提供，甲酸(批号：10010031627)由Fluka Analytical公司提供。10%水合氯醛溶液由四川大学华西临床医学院科技园动物房统一提供。10%甲醛在华西科技园病理科老师的指导下，自行配制，具体配制方法如下：200 ml甲醛原液加入双蒸水1800 ml加入PBS缓冲液粉末(ZLI-9062,中杉金桥)1袋。升降散(僵蚕6 g，蝉蜕3 g，姜黄9 g，生大黄12 g)免煎颗粒购于四川省中医院成都中医药大学附属医院。按照原方生药比例将免煎颗粒混合，再加入适量超纯水，超声溶解30 min，配制出0.5 g/ml浓度的中药溶液，并在37 ℃温水浴保存备用。

1.3 实验方法 24只小鼠经1周适应性喂养后禁食12 h，随机分为四组：假手术组、模型组、升降散治疗组与GSK180治疗的对照组。假手术组为非AP-MODS模型组，模型组、治疗组与对照组均为AP-MODS模型。根据已有文献[8]，本实验通过腹腔注射雨蛙素(50 μg/kg，共6次，每次间隔1 h)和脂多糖(10 mg/kg，第7次)获得小鼠AP-MODS模型。造模2 h后，假手术组和模型组均用0.9%氯化钠溶液按5 g/kg剂量灌胃，治疗组用0.5 g/ml升降散按5 g/kg剂量灌胃，对照组用KMO抑制剂GSK180按30 mg/kg剂量腹腔注射。整个实验过程中，保持禁食不禁饮。造模12 h后，处死小鼠，取血清备用；取胰腺、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、结肠新鲜组织，充分浸泡在10%甲醛中备用。

1.4 指标检测 ①采用全自动生化分析仪(Roche Cedex Bio C501)检测血清中的淀粉酶、脂肪酶水平。②将血清送往四川广电检测中心，采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)检测其中色氨酸-犬尿氨酸通路的主要代谢产物(TRP、5-HT、KYN、3-HK、KYNA)浓度。③将甲醛浸泡固定好的组织送到四川大学华西医院科技园生物技术中心病理平台进行石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色等处理。处理好的组织标本交由两位病理科老师采用盲法在光学显微镜下分别对胰腺、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、结肠进行组织病理性损伤观察和病理评分(项目编号：XM180096P)。具体的评分标准详见参考文献[9-12]。

1.5 统计学方法 采用Graph Pad Prism 8.0统计学软件进行分析。计量资料用均数±标准差表示。如数据呈正态分布且满足方差齐性，则两组间比较选用t检验；如数据不满足正态分布，则两组间比较选用Mann-Whitney test；P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平比较 与假手术组相比，模型组小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平均明显升高(P<0.05)。与模型组相比，升降散治疗组小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平均明显降低(P<0.05)。与模型组相比，GSK180治疗的对照组小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平均明显降低(P<0.05)。但治疗组与对照组小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平比较(U/ml)

2.2 各组小鼠血清色氨酸-犬尿氨酸通路的主要代谢产物水平比较 与假手术组相比，模型组中TRP、5-HT、KYNA水平均明显降低， KYN和 3-HK水平均明显升高，且差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，升降散治疗组KYNA升高，3-HK降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，GSK180治疗的对照组KYN、3-HK水平降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。 治疗组与对照组相比，仅KYN水平的差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血清色氨酸-犬尿氨酸通路的代谢产物水平比较(ng/ml)

2.3 各组小鼠多个组织病理损伤及评分比较 由各组织病理图可知，与假手术组相比，模型组中的胰腺组织出现明显的腺泡肿胀和间隙增宽，胰腺实质有感染且可见灶状出血点；在治疗组中仅可见小叶间隙增宽，区域性水肿及胰腺管边缘轻度感染；对照组中可见胰腺小叶间隙重度增宽，糜烂性水肿，腺泡感染和少许出血。与假手术组中正常肺脏相比，模型组中肺泡间质细胞肿胀、疏松有缺损，肺泡腔内有大量液体，可见灶性炎症、出血和坏死，并有小血管微血栓乃至中-大灶肺不张形成；而治疗组与对照组中炎症减轻，伴少量坏死及透明微血栓，仅轻微肺不张。与假手术组中正常心肌相比，模型组中心肌纤维束明显增宽，炎症细胞增多，心肌片状或弥漫性出血；而治疗组及对照组中仅可见少许炎症细胞、出血点及心肌纤维囊肿。与假手术组中正常肝脏相比，模型组中可见肝内炎细胞呈弥漫性浸润甚至形成脓肿，伴弥漫性空泡变性、出血和片状坏死；而治疗组及对照组中仅可见炎症细胞灶性浸润，轻中度肝窦内瘀血。与假手术组中正常肾脏相比，模型组中炎症细胞呈弥漫性浸润，肾小管出现灶性出血，肾曲管上皮发生空泡变性；治疗组中可见肾内局灶性炎症，肾小管点灶性出血，近曲小管上皮浊肿变形；而对照组中仅可见肾内点灶状炎症，肾小管点灶性出血，近曲小管上皮轻度浊肿变形。与假手术组中正常结肠相比，模型组中可见广泛炎细胞浸润，灶性出血，黏膜下线样间隙，黏膜表层轻度糜烂脱落；而治疗组与对照组中结肠腺体感染面积减少，仅固有层毛细血管充血(图1)。

图1 各组小鼠多个组织病理图(HE染色，×200)

相应的，与假手术组相比，模型组中胰腺、肺脏、心脏、肝脏、肾脏和结肠的组织病理评分明显升高(P<0.05)。与模型组相比，升降散治疗组多个组织病理评分降低，其中胰腺、肺脏、肾脏和结肠的评分差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，GSK180治疗的对照组除结肠以外多个组织的病理评分明显降低(P<0.05)。治疗组与对照组相比，胰腺与肾脏的病理评分差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠多个组织病理评分比较(分)

3 讨 论

中医学认为，AP属“脾心痛、结胸、胰瘅”范畴，其发病部位在脾，与肝、胆、胃密切相关，并涉及心、肺、肾、肠等多个脏器[13-14]。AP的病理性质以里、实、热证为主，其主要病机是各种致病因素引发的气机不畅，脾胃运化失司，进而导致实热内蕴，热瘀互结[15]。“腑气不通，不通则痛”，故而本病的治疗应遵循通里攻下的原则。升降散，首见于明代张鹤腾的《伤暑全书》，由僵蚕、蝉蜕、姜黄、大黄构成，具有升清降浊、解郁宣透、降火泄热之功效[16]。已有文献报道[17]，升降散可显著降低AP患者的炎性指标，并改善其临床症状及预后。本次实验中，经升降散治疗AP后，小鼠的血清淀粉酶、脂肪酶及包括胰腺在内的多个器官组织病理评分均明显低于AP模型组。这一结果提示，升降散不仅可以有效治疗AP，并能保护多个远端器官，缓解MODS。已有研究表明，升降散可能是通过调控促炎-抗炎反应来防治AP-MODS，但具体的机制和靶点并不清楚[6]。急性胰腺炎发作时，持续失控的全身炎症反应会消耗大量的氧气和能量来满足身体的需求，导致营养代谢紊乱[18]。当氨基酸代谢紊乱时，有害代谢物会积聚并诱导氧化应激，增加全身炎症反应，加重器官组织损伤[19-20]。色氨酸-犬尿氨酸代谢通路是AP发病的重要炎症信号通路之一，色氨酸(TRP)是人体无法合成的九种必需氨基酸之一，主要的代谢途径是通过KYN途径[21]。文献表明，TRP-KYN代谢通路与急性胰腺炎发病机制密切相关[22]。在正常情况下，TRP主要代谢产物为KYN(95%)和5-HT，其中，KYN的增加通常伴随炎性反应的增强[23-24]。KYN进一步生成 KYNA、3-HK和喹啉酸[25]。其中，喹啉酸可以促进炎症，而KYNA可通过抵抗喹啉酸间接减轻炎症[26]。3-HK可加剧炎症反应并导致细胞损伤，是 AP-MODS发病机制的核心[27]。KMO是KYN代谢为3-HK的关键限速酶[28]。由此可知，调控TRP-KYN炎性通路可能是治疗AP-MODS的重要途径；抑制KMO活性，减少促炎产物3-HK生成，可能是治疗AP-MODS的重要靶点。在本研究中，经AP-MODS造模后的小鼠，血清中TRP-KYN通路中的关键代谢产物均较假手术组发生显著改变，且促炎产物KYN、3-HK明显增加，抗炎产物KYNA明显下调，提示该通路为AP-MODS发病的重要信号通路之一。有实验证明，采用KMO特效抑制剂GSK180治疗后的AP-MODS大鼠模型，其多器官病理损伤明显减轻[7]。本实验中，采用GSK180治疗后，对照组小鼠的血清指标和多器官病理评分明显下降，且促炎产物KYN、3-HK浓度明显下降。该结果从小鼠AP-MODS模型中再次验证调节TRP-KYN炎性通路，抑制KMO活性是治疗AP-MODS的重要途径。此外，本实验发现，与模型组相比，经升降散治疗的AP-MODS小鼠，血清中TRP-KYN通路代谢物水平改变，且促炎产物3-HK明显下调，抗炎产物KYNA明显上调，其作用效果与GSK180特效抑制剂高度类似。因此，我们推测，升降散对AP-MODS的保护机制可能与调节TRP-KYN炎性通路，抑制KMO活性密切相关。但本实验尚不能说明升降散与GSK180谁更能有效抑制KMO活性，需要更进一步的研究。

通过比较各组的病理损伤情况，我们发现雨蛙素与脂多糖联合使用造模后，胰腺及胰腺外器官均出现明显的病理损害，即AP-MODS模型建立成功，这与近期文献报告中的结果一致[29]。虽然GSK180与升降散均可显著减轻多个器官的病理损伤，表现出相似的AP-MODS保护效果，但二者在胰腺和肾脏中的病理评分差异是具有统计学意义的。其中，升降散治疗组的胰腺病理评分显著低于对照组，这就提示升降散可能较GSK180能更好的保护AP病程中的胰腺组织。而对照组的肾脏病理评分显著低于升降散治疗组，提示GSK180可能较升降散能更好地保护AP病程中的肾脏组织。这一结果可能为临床上药物的合理使用提供依据，但需要更多的研究来证实。