丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路在穿心莲内酯治疗心肌缺血/再灌注损伤大鼠中的分子机制

田俊斌，赵 静，吕建瑞，罗 斌，马 磊

(西安交通大学第二附属医院麻醉科，陕西 西安 710004)

心肌缺血/再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury，MI/RI)是指冠状动脉的血流在恢复供应之后，心脏的结构损伤和功能障碍进一步加重的现象[1]。西医认为MI/RI与氧自由基损伤[2]、钙超载[3]、炎性反应[4]、线粒体损伤[5]等有着密切的关联，但目前尚无成熟有效的技术或疗效确切的药物防治此病。近年来国内外学者采用传统中医药治疗 MI/RI效果较好，优势明显[6-7]，但是中医药汤剂在治疗MI/RI时存在有效药理成分不明确的问题，因此采用中药提取物治疗MI/RI是当前研究的热点。目前，研究显示[8]多种中药提取物在抑制MI/RI炎性反应、降低心肌梗死面积等方面具有独特的优势，特别是萜类化合物[9-10]。穿心莲内酯(Andrographolide，AG)是从传统中药穿心莲中提取出来的二萜内酯类化合物，具有抗炎、抑菌、抗肿瘤、保护心血管系统与神经系统[11]等多种药理活性。前期研究证实[12]AG可通过抑制炎症反应，同时减少心肌细胞凋亡，保护MI/RI大鼠的心肌组织，基于其具有调节炎症的作用，而丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(Mitogen-activated protein kinase/Extracellular-regulated kinase，MAPK/ERK1/2)信号通路与炎症密切相关，因此我们推测穿心莲内酯调节MI/RI可能与MAPK/ERK1/2信号通路相关。为此本研究拟通过常规手术构建MI/RI大鼠模型，从MAPK/ERK1/2信号通路探究AG干预MI/RI可能的作用机制，以期为MI/RI的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠共60只，大鼠为SPF级，体重为180～220 g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供[SYXK(陕)2018-001]，大鼠饲养于标准动物饲养间，日常光源为日光灯，光照时间为12 h，室温由中央空调统一控制，温度控制为 22～26 ℃，湿度也由中央空调控制，设置范围为 45%～55%，所有大鼠均自由摄取食物和自由饮用水。

1.2 实验药物及试剂 AG(含量97%，CAS号：5508-58-7)；银杏内酯B(含量98%，CAS号:15291-77-7)；乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(批号：CSB-E11324r)；肌酸激酶同工酶(Creatine kinase isoenzymes，CK-MB)试剂盒(批号：CSB-E14403r)；心肌肌钙蛋白(cardiac troponin,cTnI)试剂盒(批号：CSB-E08594r)；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)试剂盒(批号：A003-1-2)；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)试剂盒(批号：A001-3-2)；三磷酸腺苷酶(Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP) 测定试剂盒(批号分别为ml076297和ml076296)；分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases,p38-MAPK)抗体(批号：sc-33688)；磷酸化细胞外信号调节激酶(Extracellular-regulated kinase，p-ERK1/2)抗体(批号：4370)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体[批号：(G-9)sc-365062]；引物购于上海生物生工。

1.3 分组与给药 大鼠适应性喂养2周后，依随机数字表法将其分为六组，每组10只，分别为假手术组、模型组、阳性药物银杏内酯B干预组、AG低、中和高剂量组，分组后于次日给予相应药物预防给药治疗，假手术组和模型组给予0.9%氯化钠溶液1 ml/(kg·d)灌胃给药，银杏内酯B干预组给予银杏内酯B 2 mg/(kg·d)灌胃给药，AG三个剂量组分别给予25 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)灌胃给药，剂量根据文献报道确定[13]，连续给药14 d。

1.4 模型制备 参照文献报道[14]的方法，于给药结束后构建MI/RI大鼠模型。模型构建时，所有大鼠均于前夜分批次给予禁食12 h，次日取出采用戊巴比妥钠麻醉，待麻醉后固定四肢和头部于解剖板，并将气管切开连接呼吸机，后由专业人员操作分离肌肉组织，找到心脏，缺血模型构建：用5-0号丝线在心脏的分支起点处结扎(方法为冠状动脉左前将支法)，结扎后密切观察心电图，当心电图上显示有明显ST段抬高，同时肉眼可见心肌壁呈现出明显膨出和发绀表明缺血构建成功，此时开始计时，结扎30 min；再灌注模型构建：结扎30 min后，关闭大鼠胸腔，再灌注120 min，同时心电图显示为ST段回落>1/2，表明再灌注模型构建成功。假手术组则只给予开胸而不结扎。

1.5 标本采集与相关指标检测

1.5.1 血清 LDH、CK-MB和cTnI检测：MI/RI模型构建成功后，采用10 ml注射器从腹主动脉取血，血液收集后，采用低温高速离心机4000 r/min离心10 min，离心后收集血清，采用相应试剂盒检测LDH、CK-MB和cTnI即可，多余血清放入超低温冰箱中保存备用。

1.5.2 心肌组织收集方法：血液收集后，即取出心脏，心脏收集后，立即将其切成4小块(标记为a、b、c和d)，其中a小块用于心肌组织中的相关生化指标检测，b小块放入组织固定液中固定后用于病理学检测，c小块置入RNA保护液中固定用于RNA检测，d小块置于超低温冰箱中用于相关蛋白检测。

1.5.3 心肌组织MDA、SOD、Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP的检测：将a小块的心肌组织取出并匀浆，完成后离心，收集上清液根据试剂盒提供的说明书检测MDA、SOD、Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP含量即可。

1.5.4 心肌组织HE染色：将b小块心肌组织从组织固定液中取出，根据文献报道方法[15]，依次经脱水、透明、切片、封片，苏木精伊红染色、封片即完成，完成后采用光学显微镜观察并采集图像，每张切片选取6个不同的视野。

1.5.5 p38-MAPK和p-ERK1/2蛋白检测：从超低温冰箱中取出d小块心肌组织，采用总蛋白提取试剂盒按照试剂盒提供的说明书将心肌组织中总蛋白提取出来，后将其定量并调平，每组各取30 μg行SDS-PAGE凝胶电泳，完成后转移到PVDF膜，依次经脱脂牛奶封闭、一抗(p38-MAPK为1∶1000、p-ERK1/2为1∶1000和GAPDH为1∶5000)过夜孵育、二抗(1∶5000)孵育后暗室曝光洗片、扫描仪扫描收集图像后，Image J测算灰度值，结果以所测蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值比较。

1.6 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，结果比较分析均符合正态分布，采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 术中共死亡7只大鼠，其中5只发生心率失常，2只大出血，假手术组、模型组、银杏内酯B干预组、AG低、中和高剂量组分别死亡0、2、1、1、2和1只。其余造模均成功。

2.2 心肌组织病理学表现 心肌组织病理学可见，假手术组心肌细胞大小均匀，排列整齐，模型组大鼠心肌纤维断裂，出现水肿、细胞排列无规则，同时细胞间隙增大，与模型组相比，各治疗组均有所缓解(图1)。

A：假手术组；B：模型组；C：银杏内酯B干预组；D：AG低剂量组；E：AG中剂量组； F：AG高剂量组

2.3 心功能指标比较 与假手术组相比，模型组大鼠心肌梗死面积占心脏总面积百分比(IS/AAR)、血清 CK-MB和cTnI均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，银杏内酯B干预组和AG低、中高剂量组IS/AAR、CK-MB和cTnI 均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清心功能指标LDH、CK-MB 和 cTnI比较

2.4 心肌组织能量代谢指标比较 与假手术组相比，模型组心肌组织能量代谢指标Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，银杏内酯B干预组和AG各剂量组上述指标均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，但AG三个剂量组和银杏内酯B干预组无统计学差异。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织能量指标Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP比较(μmol/mgprot·h)

2.5 心肌组织中MDA和SOD比较 与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织中SOD活力明显降低，MDA含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，银杏内酯B干预组和AG低、中和高剂量组大鼠心肌组织 MDA降低，SOD升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠心肌组织抗氧化指标MDA和SOD比较

2.6 p38-MAPK和 p-ERK1/2蛋白表达比较 与假手术组相比，模型组大鼠心肌中p38-MAPK蛋白表达明显升高，p-ERK1/2蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义；与模型组相比，银杏内酯B干预组和AG三个剂量组p38-MAPK蛋白表达降低，p-ERK1/2蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义。见表4(图2)。

表4 各组大鼠心肌组织p38-MAPK和p-ERK1/2蛋白相对表达比较

A：假手术组；B：模型组；C：银杏内酯B干预组；D：AG低剂量组；E：AG中剂量组； F：AG高剂量组

3 讨 论

穿心莲又名春莲秋柳，药性归心、肺、大肠以及膀胱经，是中医药常用的中草药植株之一。相关文献报道[16]，穿心莲具有极高的药用价值，特别是其含有多种保护心血管病的有效药理活性物质，近年来在心血管病领域得到了较多的研究。AG是从穿心莲全草或叶中提取的一种二萜内酯类化合物，为穿心莲的主要活性成分。黄志华等[17]构建了异丙肾上腺素损伤的心肌梗死大鼠模型，研究结果发现，给予上述大鼠穿心莲内酯注射可有效保护心功能。此外，我们课题组在前期工作中也发现，AG可以通过降低血脂，同时抑制心肌细胞凋亡，保护高脂血症大鼠MI/RI的心肌组织[12]。

一般而言，血清心肌酶谱的表达异常可以判断心肌损伤的严重程度，而代表性的蛋白酶主要有LDH、CK-MB和cTnI等[18]。本课题采用AG预防给药干预MI/RI大鼠，首先评价了其对心肌相关指标的影响。本研究结果显示，与假手术组相比，AG可以明显降低MI/RI大鼠血清LDH、CK-MB和cTnI的含量，同时心肌组织病理学有明显改善，这提示AG预防给药能够改善MI/RI大鼠心功能，进而保护心肌。之后我们观察了AG对心肌组织能量代谢指标Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP的影响，Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP是心脏发挥作用的代表因子，二者可直接反应心肌的功能[19]，研究结果发现，AG预防给药可明显提高心肌组织能量代谢指标Ca2+-Mg2+-ATP和Na+-K+-ATP的表达，进而保护心肌。

MI/RI发生后可引起机体产生氧化应激反应，而在氧化应激发生过程中蛋白激酶信号转导通路与其关系密切，其中与心肌氧化应激密切相关的主要有p38-MAPK和p-ERK1/2两个蛋白[20-21]。有研究显示p38-MAPK和p-ERK1/2可直接反应MI/RI心肌的损伤特点，可以作为MI/RI的标志[22]。此外p38-MAPK和p-ERK1/2可以直接调控MDA和SOD的表达，其中MDA是脂质过氧化的主要产物，其含量越高表明心肌损伤越严重，而SOD是机体主要的抗氧化酶，其可有效的清除自由基，进而减轻机体对组织的伤害[23]。本研究结果显示，AG可明显降低MI/RI大鼠心肌组织 MDA含量，同时提高SOD活力，这提示AG可通过降低心肌氧化应激进而减缓心肌损伤。此外研究结果还显示，AG可明显降低心肌细胞中p38-MAPK蛋白表达，同时升高p-ERK1/2蛋白表达，提示AG可能通过调节p38-MAPK和p-ERK1/2蛋白进而抑制氧化应激，最终减轻MI/RI。

综上所述，本研究结果显示，AG对MI/RI大鼠心肌具有明显的保护作用，同时改善心肌酶谱相关表达，提高心肌组织能量代谢，其作用机制可能与AG改善p38-MAPK和p-ERK1/2蛋白表达，进而提高心肌抗氧化能力有关。