烟粉虱持续取食对棉花叶片防御酶活性、营养物质和代谢产物含量的影响

贾尊尊, 付开赟, 丁新华, 吐尔逊·阿合买提,姜卫华，王小武, 郭文超

(1. 新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 843005；2. 新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091；3. 南京农业大学植物保护学院，南京 844200；4. 新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】 外来入侵性昆虫由于其强繁殖力及适应性，使得入侵地的生态平衡遭到破坏[1]，烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)是入侵性极强的农业害虫[2]，对于寄主植物危害在于刺吸叶片使得叶片生理性受损，分泌蜜露造成叶片煤污病，还会携带植物病毒病[3]。烟粉虱是使用口器刺入植物叶片组织吸取营养，造成植株叶片退绿或萎蔫，诱导植物的防御机制产生[4]，烟粉虱所携带的棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl virus, CLCuV) 对棉花生产造成威胁[5]。研究不同虫口密度烟粉虱在不同时间胁迫棉花苗期植株后，观察其体内丙二醛、脯氨酸、过氧化氢酶、可溶性蛋白含量、可溶性糖和叶绿素含量的变化，分析棉花对烟粉虱造成的虫害胁迫所产生的防御机制产生的生理生化影响，进一步研究烟粉虱与棉花的互作关系，对控害和预防烟粉虱的发生有重要意义。【前人研究进展】 叶绿素是植物光合作用关键物质[6]，其含量可受多种逆境的胁迫而下降，与植物的光合能力、发育阶段相关性显著，也是植物抗逆性生理指标之一[7]。植物营养物质在昆虫取食后其含量发生变化，其变幅决定了植物对昆虫的防御能力[8]，可溶性糖能够刺激昆虫取食，也是其重要营养物质和能量来源[9]；可溶性蛋白含量的高低影响昆虫生长发育与存活率[10]，植物氨基酸含量的高低与植物抗虫性密切相关[11]，脯氨酸(Pro)是一种多功能的氨基酸，主要维持植物遭受逆境胁迫下细胞的正常功能，其作用可协助调控细胞氧化还原势和稳定细胞渗透压等[12-14]。丙二醛(MDA)是植物膜脂过氧化反应的代谢产物[15]，过氧化氢酶(CAT)是抗氧化活性氧代谢相关的关键性酶，其作用可以缓解MDA的积累，使得植物形成对胁迫的防御机制，提高植物的抗性[16-17]。【本研究切入点】 昆虫与寄主植物之间生态关系随着时间不断进化演变逐渐形成某种化学联系[18]，植物对昆虫会产生一种防御机制来抵挡昆虫的攻击、产生次生代谢物质以吸引天敌或者恢复受害部[19]，这种防御机制具体表现为植物自身体内生理生化指标变化，如叶绿素的变化改变光合作用，保护酶增多、渗透物质增加，次生代谢物质及营养物质发生变化等[20-21]。亟需研究不同密度与不同为害时间下，棉花植株对烟粉虱持续取食胁迫所产生防御应答响应。【拟解决的关键问题】 研究烟粉虱在不同虫口密度与为害时间下，棉花苗期叶片的营养物质及代谢物质可溶性蛋白、可溶性糖、叶绿素、丙二醛、脯氨酸及过氧化氢酶含量动态变化规律，分析烟粉虱与棉花植株的互作关系。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 烟粉虱

MED烟粉虱采自新疆农业科学院植物保护研究所内，寄主植物为南瓜，分别使用COI测序以及CAPs方法[22]鉴定为Mediterraean (MED) 隐种，后在NJ-135棉花植株上罩笼扩繁。使用棉花NJ-135，催芽后移入盆内在养虫网内移栽，长至8片叶后接虫。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

取棉花苗期植株，罩笼140目尼龙网，单株分别接虫0头、50头、500头烟粉虱，重复5次，成虫分别取食24、48和72 h后采样，后用于相关指标的测定。

1.2.2 测定指标

1.2.2.1 植物营养物质

采用蒽酮比色法植物可溶性糖测定[23]，糖与浓硫酸发生经脱水反应会生成糖醛或者羟甲基糖醛，所生成的糖醛或羟甲基糖醛均可与蒽酮显色反应，可生成蓝绿色的衍生物，在630 nm可见光下测定其吸光度值。

植物可溶性蛋白测定使用BCA法[24]，在碱性的条件下，蛋白可将二价铜离子还原为一价铜离子，同时一价铜离子可与BCA试剂发生显色反应形成紫色络合物，在562 nm处有最大的吸收峰，吸光度与浓度成正比，测吸光度，计算待测蛋白的浓度。

测定植物体内所含有的氨基酸中的脯氨酸(PRO)使用酸性茚三酮与其发生的相关显色反应所生成红色产物，测定515 nm可见光的吸光度值[25]。

1.2.2.2 植物叶绿素

叶绿素a和叶绿素b在663 nm分别具有最大吸收峰，根据叶绿素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在最大吸收波长测定其吸光度，从而计算总叶绿素含量[26]。

1.2.2.3 丙二醛

使用TBA法，MDA可以与硫代巴比妥酸(TBA)缩合发生显色反应，最终反应生成红色产物，在532 nm处会有最大的吸收峰，随后使用测得吸光度计算丙二醛浓度[27]。

1.2.2.4 过氧化氢酶

使用钼酸铵法，H2O2与钼氨酸的反应[28]，产生的络合物为淡黄色，加入钼氨酸可使过氧化氢酶(Catalase)分解H2O2的反应迅速终止，在405 nm处可有最大峰，计算过氧化氢酶活力。

1.3 数据处理

可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、叶绿素、丙二醛及过氧化氢酶的含量使用SPSS数据处理软件的邓肯 (Tukey) 进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同时间与密度的虫害胁迫下棉花营养物质含量的变化

研究表明，24、48和72 h的处理组中，对照间差异不显著(16.16, 16.77和18.10 mg/g)。在50头/株的处理下，随着烟粉虱持续取食时间延长，可溶性糖含量降低。在处理24、48和72 h后，可溶性糖含量降低(16.77，15.83和15.64 mg/g)，但差异性不显著；在500头/株密度下，可溶性糖含量降低且程度增大，随着持续取食时间的延长在24、48和72 h其含量依次为18.10、15.75和7.84 mg/g，处理72 h与处理24和48 h含量存在显著性差异。在相同的烟粉虱持续取食时间下，取食24 h后随着虫口密度的增加可溶性糖含量上升，500头/株的含量最高，差异性不显著；取食48和72 h，均表现为随着虫口密度的增加可溶性糖含量下降；而取食72 h后，这种下降程度表现更加明显，密度为50头/株的处理组与对照组相比下降14 %，处理密度为500头/株，下降了57 %，仅密度为500头/株处理组与对照相比可溶性糖含量差异性显著。图1

烟粉虱持续取食胁迫下，棉花叶片的总蛋白含量均上升。对于50头/株处理组，随着为害时间的延长总蛋白的含量逐渐升高，24、48和72 h总蛋白含量分别为3.23、4.87和5.55 μg/mL，且差异性显著；500头/株处理组，随着为害时间的延长总蛋白含量同样也为逐渐升高的趋势，24、48和72 h总蛋白含量分别为3.84、5.38和5.92 μg/mL；在相同处理时间，可溶性蛋白的含量随着虫口密度的升高而升高。图2

烟粉虱对棉花植株为害后，棉花叶片脯氨酸含量随为害时间延长其含量逐渐升高，500头/株处理组，为害72 h下与为害24和48 h具有显著性差异，且处理48 h与处理24 h相比脯氨酸含量增加11%，而处理72 h与处理24 h相比脯氨酸含量增加36%。随着为害时间的延长，50头/株的处理组脯氨酸含量升高，差异不显著，对于不同处理时间下，处理组与对照组相比，为害密度越大其脯氨酸含量升高，且随着为害延长，这种现象更加明显，在72 h处理时间下，随虫口密度增加，脯氨酸含量升高(0.85, 0.92和1.21 μg/g)，50头/株脯氨酸含量与对照组差异性不显著，而500头/株处理组与50头/株和对照均表现为脯氨酸含量显著升高。图3

图1 不同烟粉虱密度与持续取食时间下棉花叶片可溶性糖含量变化Fig.1 Soluble sugars content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

图2 不同烟粉虱密度与持续取食时间下棉花叶片总蛋白含量变化Fig.2 Total protein content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

图3 不同烟粉虱密度与持续取食时间下棉花叶片脯氨酸含量变化Fig.3 Proline content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

2.2 不同时间与虫口密度的虫害胁迫下棉花丙二醛含量变化

研究表明，随着为害时间的延长，虫口密度分别为50与500头/株处理组棉花叶片丙二醛含量均先降低后升高。在相同为害时间，虫口密度越高其丙二醛含量越高，且处理组与对照组相比其含量变化随着为害时间延长，丙二醛含量变幅越大，在72 h时，500头/株的处理组与对照相比增加55%，而50头/株的处理组与对照组相比增加34%，而为害时间在24和48 h时，500头/株与对照相比分别增加33%和19%；50头/株与对照组相比分别增加13%和0%。图4

图4 不同烟粉虱密度与持续取食时间下棉花叶片丙二醛含量变化Fig.4 Malondialdehyde content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

2.3 不同时间与虫口密度的虫害胁迫下棉花过氧化氢酶(CAT)含量变化

研究表明，相同处理时间下，过氧化氢酶活力变化均随为害密度增大而增加(6.42, 9.81和12.42 U/mg prot；7.40,10.98和15.29 U/mg prot；10.74,18.45和19.16 U/mg prot)；相同处理密度下，过氧化氢酶活力变化随烟粉虱持续取食时间延长而增大。在烟粉虱持续取食24和48h， 500头/株与对照间均差异性显著。在烟粉虱持续取食72 h后，50头/株和500头/株处理组与对照组相比均差异性显著。图5

2.4 不同时间与虫口密度的虫害胁迫下棉花植物叶绿素含量变化

研究表明，24和48 h处理，处理组与对照组随着虫口密度的增加叶绿素含量显著下降，而在为害时间延长至72 h，50头/株处理组与500头/株对于50头处理组间叶绿素含量差异性不显著，但与对照间均表现差异性显著增高的情况。500头/株随着为害时间的延长，叶绿素含量升高，48 h比24 h升高72%，72 h比48 h升高129%，对于50头/株处理组，叶绿素含量先下降30%后上升113%。不同处理密度，随着为害时间的延长，棉花叶片内叶绿素含量呈现下降后上升的情况，对照间无显著性差异。图6

图5 不同烟粉虱密度与持续取食时间下棉花叶片过氧化氢酶含量变化Fig.5 Catalase content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

图6 不同烟粉虱密度与持续取食时间下棉花叶片叶绿素含量变化Fig.6 Chlorophyll content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

3 讨 论

植物对虫害胁迫的响应表现为不同物质的生理生化指标在昆虫为害后发生改变，如营养物质、次生代谢物质、防御酶以及植物激素等，变化来抵御昆虫侵害[29]。烟粉虱的口器为刺吸式，其为害作物的方式为吸食食物叶片造成植物生理性受损[30]，发现烟粉虱对棉花进行取食胁迫后，棉花叶片的营养物质中可溶性糖、可溶性蛋白和游离氨基酸脯氨酸均产生了不同程度的变化，且变化程度与烟粉虱的为害密度和为害时间密切相关，72 h的处理时间中，可溶性糖的含量随着为害密度升高含量降低，随着为害时间延长含量降低，脯氨酸和总蛋白含量的变化是随着为害密度的升高而含量升高，随着为害时间的延长含量上升。植物的可溶性糖是存在于叶肉细胞中的营养物质，也是植物的抗逆性境调控的重要组成物质，是刺吸式口器昆虫直接吸食的物质，随着昆虫的吸食使得叶片中可溶性糖含量降低，与前人研究结论一致[23]，脯氨酸和总蛋白含量的变化，很大可能性是植物本身的防御机制对刺吸式口器昆虫为害产生的一种生理补偿反应，是对虫害胁迫的应答，其体内总蛋白含量上升，脯氨酸含量长期研究在植物受到逆境胁迫的条件下会在植物体内积累[31]，最初发现游离的脯氨酸的大量积累的现象出现在萎蔫的黑麦草中[32]，脯氨酸长期研究发现其作用是作为细胞的有效渗透调节物质，同时能够保护酶和膜的结构，一直以来相关研究多将脯氨酸作为细胞结构与功能受损评价指标[31]。在较低密度烟粉虱为害棉花叶片，棉花叶片的叶绿素含量是先下降后上升的，而对于较高虫口密度下对棉花为害，叶绿素含量随处理时间延长而升高。

植物在虫害胁迫的情况下，其体内保护酶系的含量和活性上升可用于维持植物体内自由基的产生和清除之间的平衡，预防膜脂过氧化的反应的发生[33]；但当虫害胁迫的时间及胁迫的程度加剧，使得活性氧、自由基产生就会明显增加，破坏植物体内保护酶系能够维持的平衡，导致自由基积累，造成膜脂过氧化。丙二醛(malondialdchydc MDA)是膜脂过氧化反应的产物之一，通常利用它作为脂质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和对逆境地条件反应的强弱[34-37]。研究发现，不同密度为害棉花叶片内丙二醛的含量随着为害时间的增长其变化是先降低再升高的，而在相同为害时间内，丙二醛含量随着虫害密度增加而升高。过氧化氢酶CAT是ROS系统中的一种关键性的保护酶，是植物体内常见的以铁卟啉为辅基的酶类清除剂其主要功能是促使过氧化氢分解为氧和水，避免过氧化氢的积累，以维护细胞膜的稳定性[38-39]，通过系统研究了烟粉虱不同密度和取食持续时间对棉花防御酶酶活性、营养物质与代谢产物含量的变化，发现了CAT活性变化、蛋白质、可溶性糖、脯氨酸、丙二醛和叶绿素的含量变化均与烟粉虱取食棉花叶片相关。研究仅从烟粉虱MED隐种为害棉花叶片，在不同为害时间和为害密度的条件下其叶片的营养物质以及叶绿素、丙二醛以及相关防御酶等物质含量变化的角度去揭示棉花受虫害胁迫后其防御应答机制，但对于更深层次的原因还需要进一步的发掘和研究。

4 结 论

4.1棉花对烟粉虱持续取食胁迫产生应答响应，与棉花生理生化性质改变相关。烟粉虱对棉花的取食为害作用部位一般在叶片背面，在棉花叶片上，不同取食密度和持续取食时间均是造成棉花叶片营养物质、代谢产物和防御酶活力发生变化的原因。

4.2不同密度烟粉虱持取食棉花叶片后，叶片中3种营养物质含量动态变化不同。在持续取食24 h后，棉花叶片可溶性糖含量随密度升高逐渐增高(16.16, 16.77 和18.10 mg/g)；在持续取食48和72 h后，其含量均随密度升高而降低，取食时间延长会增加降低的程度。总蛋白含量随着烟粉虱密度增加而升高，随烟粉虱持续取食时间延长而升高，在500头/株处理下，烟粉虱胁迫72 h 后，含量最高(5.92 μg/mL)。脯氨酸含量的变化与总蛋白含量动态变化情况一致，均随着烟粉虱密度增加而升高，随烟粉虱持续取食时间延长而升高，脯氨酸含量在500头/株处理组持续取食72 h后含量最高。

4.3丙二醛含量在不同密度烟粉虱持取食后，随着持续取食时间延长，丙二醛含量在50和500头/株处理密度下呈现先降低后升高的情况。在24和72 h处理下随烟粉虱处理密度升高含量升高。

4.4植物防御酶CAT随着烟粉虱处理密度增高和持续取食时间延长，含量均升高。叶绿素在烟粉虱持续取食24和48 h含量随密度升高而下降，72 h测定含量随取食密度升高而升高(1.55, 1.92和1.98 mg/g)。