458份小麦品种(系)抗病性状功能基因的KASP标记检测

王 重，张宏芝，高 新，时 佳，王立红，李剑峰，樊哲儒，赵 奇，张跃强

(1.新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐 830091；2.农业部荒漠绿洲作物生理生态与耕作重点实验室，乌鲁木齐 830091；3.新疆农作物生物技术重点实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】新疆地处亚洲大陆中心，降雨量少，蒸腾量大，气候干燥，小麦病害发生较少[1]，近年来由于气候变化、栽培方式改变、致病菌种变异以及抗病性丧失等因素，小麦种植区白粉病和锈病发生频率和病害有所加重[2]。目前防治小麦白粉病和锈病病害的主要措施是农药，将常规育种手段与分子辅助选择育种技术相结合，选育抗病分子标记聚合的育种材料或品种，对于新疆的小麦生产有实际意义。【前人研究进展】竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)是一种对特定位点处SNP以及插入和缺失(insertion-deletion，InDels)进行双等位基因分型技术，可针对绝大多数基因组DNA的SNPs和特定位点InDels，准确分析双等位基因，具有稳定性好、准确性高、无需合成特异荧光探针、检测成本较低和高通量等优点[3]。李玮等[4]对KASP对94份小麦育种亲本的功能基因进行分子检测表明，与抗性相关的Lr68优异等位变异占比为15%，未检测到Lr34和Pm21阳性材料。利用KASP标记技术对120份小麦品种(系)的重要性状功能基因进行检测，69份材料含有Lr14a，3份材料含Lr68基因，未发现含有Yr15基因材料[5]。高洁等[6]对小麦4个多效抗病基因分子标记进行了转化和再开发，并对其进行了验证。【本研究切入点】目前通过KASP检测的材料多以当地主栽品种、育种骨干亲本及衍生品系为主，针对新疆小麦品种(系)及育种亲本的抗白粉病、锈病基因分子检测少见报道。需采用KASP标记技术检测抗白粉病基因Pm21、抗条锈病基因Yr15和抗叶锈病基因Lr14a、Lr68。【拟解决的关键问题】以56份新疆小麦品种、304份小麦品系和98份引进种质资源为试验材料，研究不同小麦品种(系)抗病性状功能基因的分布状态，分析小麦品种(系)的抗病功能基因，为小麦抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 小麦品种(系)

参试小麦品种(系)总计458份材料，其中新疆审定小麦品种56份，高代稳定品系304份，引进种质资源98份。

1.1.2 KASP标记

抗白粉病标记1个，Pm21；条锈病抗性标记1个，Yr15；叶锈病抗性标记2个，Lr14a和Lr68。引物参照中国农科院作物科学研究所夏先春老师提供序列由上海生工合成。

1.2 方 法

1.2.1 小麦DNA提取

参试小麦品种(系)播种于育苗盘中，待其生长至3叶1心取叶片置于1.5 mL离心管中，钢珠震荡破碎，采用PVP40(聚乙烯吡咯烷酮40)法[7]提取小麦基因组DNA。DNA提取完成后使用Nanodrop one对DNA浓度测定，并定容至100 ng/μL。

1.2.2 抗性标记检测

以参试小麦品种(系)DNA为模板，选择中国春等5个已知分子标记品种作为阳性对照，采用扩增子拯救多重PCR(amplicon rescued multiplex PCR，arm-PCR)技术对小麦基因组DNA的抗性标记检测[8]。

1.2.2.1 PCR体系

PCR反应体系10 μL，包括DNA模板2 μL，2×KASP Mix 5 μL，引物混合液0.1 μL，ddH2O 2.9 μL。引物混合液由合成的FAM引物(100 μM)、HEX引物(100 μM)、通用引物(100 μM)和ddH2O按照12∶12∶30∶46的比例进行混合制成。

1.2.2.2 PCR程序

预变性94℃ 5 min；变性94℃ 20 sec，退火65～56℃1 min，每个循环降低1℃，10个循环；变性94℃ 20 sec，退火56℃ 1 min，30个循环。

2 结果与分析

2.1 抗白粉病基因Pm21检测

研究表明，仅有2份材料检测到Pm21标记，约占群体的0.44%，且这2份材料均为审定品种。抗白粉病分子标记Pm21在审定品种中有极少量分布，但是在目前的高代稳定品系中，以及引进种质资源中，均未发现白粉病抗性标记Pm21。图1

注:红色：无Pm21；蓝色：携带Pm21

2.2 抗条锈病基因Yr15检测

研究表明，14份材料检测到Yr15标记，约占群体的3.06%，其中，审定品种7份，高代稳定材料6份，引进种质资源1份。虽然条锈病抗性标记Yr15在参试品种(系)中的分布频率较低，但是无论在审定品种或者高代品系中均存在较为稳定的分布。图2

2.3 叶锈病抗性基因检测

2.3.1 抗性标记Lr14a检测

研究表明，22份材料检测到Lr14a标记，约占参试材料的4.80%。其中，审定品种21份，引进种质资源1份。Lr14a较为集中的分布于冬小麦审定品种中，共有20份材料，其余2份材料分布于春小麦品种和引进种质资源中。图3

注:红色：携带Yr15；蓝色：无Yr15

注:红色：携带Lr14a；蓝色：无Lr14a

2.3.2 抗性标记Lr68检测

研究表明，有48份材料检测到Lr68标记，约占供试材料的10.48%。其中，审定品种4份，高代品系15份，引进种质资源29份。虽然新疆小麦审定品种中Lr68分布较为少见，但是在目前的高代品系和引进种质资源中Lr68的分布频率显著增加。图4

注:红色：携带Lr68；蓝色：无Lr68

2.4 小麦抗病功能基因分布

研究表明，抗叶锈病功能基因Lr68的分布频率最高，达到了10.48%，其次是叶锈病抗性基因Lr14a，分布频率为4.80%，抗条锈病基因Yr15分布频率为3.06%，抗白粉病功能基因Pm21分布频率最低，仅为0.44%。在不同小麦类型中，冬小麦抗叶锈病功能基因Lr14a的分布频率较高，抗白粉病功能基因Pm21仅有的2份材料均为冬小麦，而春小麦中，抗条锈病功能基因Yr15和抗叶锈病基因Lr68的分布频率较高且多于冬小麦。根据参试小麦品种(系)不同来源分析，在审定品种中4个抗病基因均有分布，引进种质资源中未见白粉病抗性基因Pm21，条锈病抗性基因Yr15及叶锈病抗性基因Lr14a仅发现1份材料，而高代品系中Pm21和Lr14a均未检测到。表1

表1 小麦抗病功能基因分布状态Table 1 Distribution of disease-resistance genes in wheat

3 讨 论

小麦抗白粉病基因Pm21位于小麦6A染色体上，来源于簇毛麦[9-10]。由于小麦白粉病菌变异性较强，部分小麦抗白粉病基因抗性逐渐减弱甚至丧失，而Pm21在近几年的鉴定中仍然保持了很好的抗性，且具有较广的抗谱，可以作为小麦抗白粉病育种的重要抗性来源[11]。但Pm21在国内小麦品种中分布较少，李玮等[4]对94份小麦品种或高代品系进行检测，未发现Pm21阳性材料，王鑫等[12]对305份国内外小麦种质进行鉴定，仅发现1份材料含有Pm21。研究中在458份小麦品种(系)中仅检测到2份材料携带Pm21，在新疆小麦品种(系)中，Pm21的分布极少，与前人研究结果基本一致。

小麦抗条锈病功能基因Yr15位于小麦1B染色体上，来源于野生二粒小麦[13]。目前Yr15是少数几个对于中国条锈菌流行小种仍然保持较好抗性的基因[14]，对于抗条锈病小麦育种而言，Yr15是极其重要的抗性来源。邹景伟等[5]对120份小麦品种(系)进行了检测，未发现含有Yr15材料，王鑫等[12]在305份国内外小麦种质中发现10份携带Yr15材料。研究在458份小麦品种(系)中检测到含有Yr15材料14份，这与王鑫等[12]的结果基本一致，Yr15分布频率均为3%左右。在高代品系中有6份材料含有Yr15，Yr15通过杂交等手段成功导入后代材料中，进一步工作中可以加强分子标记辅助选择，筛选携带Yr15后代材料，提升新品种条锈病抗性。

小麦抗叶锈病功能基因Lr14a位于小麦7B染色体上，来源于野生二粒小麦[15-16]；Lr68也位于小麦7B染色体上，来源于野生二粒小麦，属于慢锈病基因，即反应型表现出感病，但严重度较低[17]。Lr14a和Lr68在小麦中的分布较为广泛，李玮等[4]对94份小麦品种或高代品系进行鉴定，发现Lr14a阳性率约为50%，Lr68为15%，邹景伟等[5]在120份小麦种质中发现69份材料含有Lr14a，3份材料含有Lr68。研究在458份小麦材料中检测到含有Lr14a材料22份，Lr68材料48份，这与前人结果并不一致。可能是由于春小麦材料中Lr14a的分布频率太少，导致整体分布频率偏低，而Lr68在引进种质资源中分布频率较高，并成功导入高代品系中，在高代品系中分布频率也提高。

4 结 论

小麦抗病基因Pm21、Yr15和Lr14a的分布频率仍然较低，均低于5%，而Lr68的分布频率虽然超过10%，但是在审定品种中分布频率也并不高。

新疆小麦品种(系)中抗病基因的分布频率较低，约为5%。从458份小麦品种(系)中检测到含有Pm21材料2份，含有Yr15材料14份，含有Lr14a材料22份，含有Lr68材料48份。