脂肪细胞外泌体调节NOX4/TGF-β1/Smad信号通路促进老年自发性高血压大鼠心肌纤维化

孔巴提·沙提别克 孟岩 王红

(新疆医科大学第一附属医院综合内二科，新疆 乌鲁木齐 830054)

心肌纤维化是高血压、心力衰竭、心肌炎等多种心血管疾病发展到一定阶段后常见的病理特征〔1〕，其主要表现为心肌成纤维细胞异常增殖，细胞外基质异常沉积，心肌组织中胶原比例增加，导致心肌收缩和舒张障碍〔2〕。高血压可导致心脏负担加重，引起胶原在细胞间质和血管周围沉积而加重心肌纤维化〔3〕。已有研究表明，肥胖与心血管疾病密切相关，且常见于老年高血压患者，可导致高血压患者左心室肥大〔4〕，但肥胖对老年高血压患者心肌纤维化的影响尚不明确。外泌体是一类由活细胞分泌的粒径在50～150 nm的胞外囊泡，可携带母细胞的信息经体液运输作用于近端和远端组织而影响病理生理进程，并且已有研究表明脂肪细胞外泌体与心力衰竭等心血管疾病密切相关〔5〕，而其对老年高血压患者心肌纤维化的影响尚未有明确报道，本研究旨在探讨脂肪细胞外泌体对老年自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1材料 鼠前脂肪细胞3T3-L1购自中国科学院上海生命科学研究所；DMEM培养基购自Gibco公司；12月龄SHR大鼠10只和12月龄WKY大鼠5只均购自新疆医科大学动物实验中心；白细胞介素(IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自福麦斯生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；cDNA合成试剂盒、qPCR检测试剂盒购自ABM公司；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)购自美国Sigma公司;p-细胞质果蝇蛋白质(Smad)、Smad、尼克酰胺腺嘌呤氧化酶(NOX)4、转化生长因子(TGF)-β1、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体、山羊抗兔二抗均购自CST公司。

1.2脂肪细胞的培养与诱导 取液氮保存的3T3-L1前脂肪细胞于37℃水浴锅中快速解冻，加入等体积的DMEM培养基稀释后，1 000 r/min离心5 min，细胞重悬后于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞生长汇合率达80%时进行传代。将前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞，具体步骤为：取对数生长期的3T3-L1细胞，调整细胞密度为5×103个/ml，接种于12孔板，首先加入诱导培养基A(每100 ml DMEM培养基加入10 μl 10 mmol/L地塞米松溶液、100 μl 0.5 IBMX溶液、100 μl 10 mg/ml胰岛素溶液)诱导4 d，然后换成诱导培养基B(每100 ml DMEM培养基加入100 μl 10 mg/ml胰岛素溶液)诱导4 d，然后换成DMEM完全培养基培养4 d即可进行后续实验。

1.3脂肪细胞外泌体的提取与鉴定 诱导成熟的3T3-L1细胞使用含10%的无外泌体胎牛血清的DMEM培养基培养48 h，收集细胞培养上清，采用差速离心法提取外泌体，具体步骤为：将所收集的细胞上清分装到10 ml的离心管中，首先3 000 r/min，4℃离心15 min，去除死细胞；然后6 000 r/min离心40 min，去除细胞碎片；10 000 r/min离心1 h，取上清；100 000 r/min离心1 h，收集沉淀即为外泌体，用400 μl磷酸盐缓冲液(PBS)重悬外泌体，并放在-80℃保存。

采用透射电镜观察外泌体的形态结构，具体步骤为：稀释外泌体至蛋白浓度为0.5 mg/ml。将透射电镜所用的铜网平放到称量纸上，滴加20 μl上述外泌体溶液，于红外灯下烘烤10 min；烘干后再滴加2滴磷钨酸，继续烘烤10 min，吸弃多余液体，于投射电镜下观察外泌体结构。

Western印迹检测外泌体表面生物标志物CD9、CD63、肿瘤易感基因(TSG)101，具体步骤为：取100 μl外泌体加入50 μl的放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液，于冰上裂解30 min，12 000 r/min，离心15 min后，取上清，即为外泌体总蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，取外泌体蛋白裂解液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，经转膜，封闭后CD9、CD63、TSG101一抗孵育过夜，然后二抗孵育，洗膜后，曝光成像。

1.4动物分组及给药 实验动物分为对照组(WKY大鼠)、SHR组(SHR大鼠)、exosome组(SHR大鼠)，每组5只。exosome组大鼠尾静脉注射0.5 μg/μl的成熟脂肪细胞外泌体溶液100 μl，每周注射1次，对照组和SHR组注射等体积的生理盐水，实验共4 w。

1.5各组收缩压(SBP)及左心室重量指数(LVI)测定 给药治疗前及给药后分别采用大鼠RBP-1型大鼠尾动脉血压心率测定仪测量各组SBP。治疗结束后颈椎脱臼处死，解剖取心肌组织，取左心室称重，并计算LVI。

1.6心肌胶原容积分数(CVF)和血管周围胶原面积(PVCA)检测 取左心室中段横截面心肌组织于组织固定液中固定24 h，取固定后的组织用清水清洗，依次经过70%、80%、90%、95%及无水乙醇梯度水化后，将组织分2次浸入二甲苯中，每次10 min，然后依次将组织浸入软石蜡和硬石蜡中各2次，每次30 min，然后将组织浸入石蜡液中，冷却至凝固，并于切片机上制备组织切片，制备的切片分别进行苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色，HE染色用于观察心肌组织病理变化；Masson染色观察心肌组织胶原；采用 CISA-1000计算机图像分析系统进行分析，CVF=胶原面积/总面积；PVCA=壁内小动脉管腔周围胶原面积/动脉管腔面积。

1.7ELISA检测血清炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α 治疗结束后，各组大鼠眼眶取血，室温静置1 h后，3 500 r/min，4℃离心15 min，取上层血清，按照ELISA试剂盒方法检测血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，主要步骤为：铺好一抗的96孔板内加入40 μl待测样品和10 μl生物素标记抗体后，在加入100 μl辣根过氧化物酶标记抗体，37℃孵育75 min，清洗96孔板后加入显色剂显色，终止后于450 nm波长处测吸光度，根据标准曲线计算血清TNF-α、IL-10、IL-6含量。

1.8心肌组织SOD、ROS、羟脯氨酸检测 实验结束后取各组大鼠心肌组织100 mg，于冰上匀浆均匀后，3 000 r/min离心10 min，取上清液，根据SOD和ROS检测试剂盒说明书，检测各组心肌组织SOD、ROS、羟脯氨酸水平。

1.9qPCR检测心肌组织过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ表达 取液氮保存的心肌组织加入Trizol研磨至组织完全裂解，取研磨液加入200 μl氯仿，静置5 min后，于12 000 r/min，4℃离心15 min，转移上层水相，加入500 μl异丙醇，12 000 r/min，4℃离心10 min，去上清，1 ml 75%乙醇清洗RNA沉淀后，20 μl RNA-free水重悬RNA沉淀，55℃水浴10 min，即为总RNA。使用primer premier5.0软件设计PPARγ引物，按照cDNA合成试剂盒和RT-qPCR试剂盒进行逆转录和RT-qPCR，采用ΔΔCT法计算PPARγ的表达量。β-actin 上游引物：5′-TATGACTTAGTTGCGTTACACC-3′，下游引物：5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′；PPARγ上游引物：5′-TCCGTGATGGAAGACCACTC-3′，下游引物：5′-CCCTTGCATCCT TCACAAGC-3′。

1.10Western印迹检测各组心肌组织p-Smad、Smad、NOX4、TGF-β1表达水平 取各组心肌组织50 mg加入250 μl RIPA裂解液和2.5 μl的苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制剂，匀浆器在冰上匀浆后12 000 r/min，4℃离心10 min，取上清，即为心肌组织总蛋白。采用BCA蛋白定量，然后蛋白沸水浴加热变性，然后进行SDS-PAGE，转膜，用5%的脱脂牛奶对聚偏氟乙烯(PVDF)膜封闭2 h，然后以1∶1 000比例稀释后的p-Smad、Smad、NOX4、TGF-β1一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗室温孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照电化学发光(ECL)试剂盒说明书配制发光液，并将PVDF膜浸入发光液中反应30 s，曝光并拍照。

1.11统计学方法 采用SPSS19.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1外泌体鉴定结果 采用差速离心法提取的外泌体粒径在50～100 nm，具有“杯托”样结构，符合外泌体的结构特征；Western印迹检测显示，提取到的外泌体表达Alix、Tsg101、CD9 3种外泌体标志蛋白，见图1、图2。

图1 外泌体投射电镜拍摄结果(×100)

图2 Western印迹检测外泌体标志蛋白

2.2脂肪细胞外泌体影响老年自发性高血压大鼠SBP和LVI 与对照组比较，SHR组SBP和LVI水平均显著升高(P<0.05)；与SHR组比较，exosome组SBP和LVI水平均显著升高(P<0.05)，见表1。提示脂肪细胞外泌体能够促进SBP和LVI，加重高血压及心脏损伤。

表1 各组SBP和LVI水平比较

2.3脂肪细胞外泌体对各组心肌组织病理变化的影响 HE染色结果(图3)显示，对照组心肌结构完整、心肌纤维排列整齐、没有炎症细胞浸润等病理变化；SHR组心肌纤维排列不规则、出现心肌纤维断裂、心肌细胞呈肥大状态、有少量炎症细胞浸润、心肌组织病变明显；exosome组心肌纤维排列紊乱且疏松，纤维断裂现象严重，心肌细胞肥大严重、有大量的炎症细胞浸润、细胞核分布不规则，与SHR组相比，心肌组织损伤严重，提示脂肪细胞外泌体能够加重老年高血压大鼠心肌组织病变。

2.4脂肪细胞外泌体对各组心肌CVF和PVCA的影响 根据Masson染色结果(图4)，心肌细胞呈红色，胶原组织呈绿色，对照组大鼠心肌组织排列整齐，胶原组织分布稀疏，血管周围胶原分布较少；SHR组心肌组织排列较整齐，胶原纤维及血管周围胶原分布较多；exosome组心肌组织中胶原分布大量增加，胶原纤维网断裂，血管周围胶原大量增加，提示心肌纤维化严重。相比于对照组，SHR组CVF和PVCA显著增加(P<0.05)，提示高血压能够诱发老年大鼠心肌纤维化；相比于SHR组，exosome组CVF和PVCA亦显著增加(P<0.05)，提示脂肪细胞外泌体能够促进老年高血压大鼠心肌纤维化。见表2。

图3 各组心肌组织HE染色结果(×200)

图4 各组大鼠心肌组织Masson染色结果(×200)

表2 各组CVF和PVCA水平比较

2.5脂肪细胞外泌体对各组血清炎症因子的影响 相比于对照组，SHR组IL-6、IL-10、TNF-α水平显著上升(P<0.05)，相比于SHR组，exosome组血清IL-6、IL-10、TNF-α水平亦显著上升，见表3，说明脂肪细胞外泌体能够显著促进老年高血压大鼠体内炎症反应。

2.6脂肪细胞外泌体对各组心肌组织SOD、 ROS、羟脯氨酸的影响 SHR组心肌组织SOD、 ROS、羟脯氨酸显著高于对照组(P<0.05)，说明高血压能够引起老年高血压大鼠心肌组织SOD、 ROS、羟脯氨酸含量增加；exosome组心肌组织SOD、 ROS、羟脯氨酸水平亦显著高于SHR组(P<0.05)，见表4，提示脂肪细胞外泌体能够上调大鼠心肌组织SOD、 ROS、羟脯氨酸水平。

表3 各组IL-6、IL-10、TNF-α水平比较

2.7脂肪细胞外泌体对各组心肌组织PPARγ表达的影响 SHR组心肌组织PPARγ表达量显著低于对照组(P<0.05)，exosome组心肌组织PPARγ表达量显著低于SHR组(P<0.05)，见表5，提示脂肪细胞外泌体能够显著抑制PPARγ表达。

2.8脂肪细胞外泌体对心肌组织NOX4、TGF-β1表达及Smad磷酸化的影响 相比于对照组，SHR组心肌组织NOX4、TGF-β1表达水平显著增加(P<0.05)，Smad磷酸化水平显著增加(P<0.05)；相比于SHR组，exosome组心肌组织中NOX4、TGF-β1表达水平显著增加(P<0.05)，Smad磷酸化水平显著增加(P<0.05)，见表5，图5，提示脂肪细胞外泌体能够通过促进NOX4/ TGF-β1/Smad而促进老年高血压大鼠心肌纤维化的发展。

表4 各组SOD、 ROS、羟脯氨酸水平比较

表5 各组PPARγ、NOX4、TGF-β1、p-Smad/Smad水平比较

图5 各组心肌组织NOX4、TGF-β1表达及Smad磷酸化检测结果

3 讨 论

心肌纤维化是高血压等心血管疾病共同的病理变化，心肌纤维化可导致心脏收缩和舒张功能障碍、心力衰竭、心律失常、心室重构等〔6〕，因而缓解心肌纤维化是治疗心力衰竭和心律失常等心血管疾病的重要措施。已有研究表明，肥胖与冠心病、动脉粥样硬化的心血管疾病密切相关，肥胖是高血压的重要诱因之一，且多发于老年高血压患者，控制肥胖能够有效缓解高血压〔7〕。外泌体是一类由多种活细胞分泌的纳米级囊泡，已有研究表明脂肪细胞外泌体可影响体内代谢〔8〕。本研究结果说明脂肪细胞可能通过外泌体而加重心肌纤维化。肥胖是高血压的危险因素之一，且肥胖可加重高血压患者体内的炎症，研究表明，体内脂肪代谢异常可导致炎症，进而引起血管内皮的收缩，并且激活交感神经和肾素-血管紧张素-醛固酮系统，进而促进高血压的发展〔9〕，本研究发现脂肪细胞外泌体能够加重老年高血压大鼠体内炎症反应。氧化应激与高血压的发生、发展密切相关〔10〕。氧化应激既引起血管壁增厚和血管腔狭窄，又损伤内皮细胞，导致内皮功能障碍，血管舒张性降低，增加血管收缩，引起外周血管阻力增加和血压升高〔11,12〕，进而加重心肌纤维化，本研究发现，脂肪细胞外泌体能够增加老年高血压大鼠心肌组织SOD、ROS水平，即加重心肌组织的氧化应激。PPARγ 是核受体 PPARs 的一个亚家族，主要表达于心肌组织中，可调控脂类代谢相关基因的表达，PPARγ被激活后能够增强促进脂肪酸储存基因的表达，例如脂肪酸转运蛋白、脂肪酸结合蛋白等，降低血脂水平及增强脂类代谢，临床上高血压与高脂血症常同时发生，相互影响〔13,14〕，本研究结果提示脂肪细胞外泌体可能通过抑制PPARγ的表达而影响血脂代谢及高血压的发生发展。

NOX4可促进心脏成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，进而促进心脏的纤维化，并且NOX4表达上调会引起TGF-β1表达上调，Smad家族蛋白中，Smad2和Smad3是TGF-β1介导纤维化发生的下游分子，可促进心肌组织胶原蛋白的合成〔15～17〕，本研究发现，脂肪细胞外泌体能够上调NOX4、TGF-β1及Smad的表达，即激活NOX4/TGF-β1/Smad信号通路。

综上，脂肪细胞外泌体可治疗老年高血压大鼠体内炎症、氧化应激反应及心肌纤维化，其影响心肌纤维化的机制为激活NOX4/TGF-β1/Smad信号通路。