基于HPLC检测老年痴呆患者血清淀粉样变成分的方法

刘晓丹 吕玉洋 郭梦洋 张丹,2 吕殊星 郑丽丽 孙续国

(1天津医科大学医学检验学院，天津 300203；2三河市医院检验科)

老年痴呆(AD)主要病理学特征为大脑皮质和海马区神经元细胞内外有神经纤维缠结和老年斑块形成〔1〕。目前临床诊断AD主要依据影像、临床评估〔2〕，而AD临床检验项目提出β-淀粉样蛋白、早老蛋白-1等蛋白为检测标志物〔3〕，分析这些项目检测方法的原理，均是基于免疫标记的技术进行测定，检测的这些AD标志物为淀粉样变前蛋白，并非沉积于组织内的病理性淀粉样变成分〔4〕。研究已经证明，病理性淀粉样变成分与淀粉样变前蛋白具有相同抗原性，但是分子结构不同。此外，本组先前发现AD血液存在病理性淀粉样变成分〔5〕，临床可以直接检测血液病理淀粉样变成分的检测方法。

目前大量研究支持淀粉样变蛋白聚合后可形成淀粉样变沉积〔6〕，本文探讨用高效液相色谱法(HPLC)分析发生变构的淀粉样变蛋白和(或)纤维技术，建立一步法定量检测淀粉样变成分的方法。

1 资料与方法

1.1研究对象 来自天津医科大学总医院、天津医科大学第二医院神经内科诊治中心确诊的AD患者6例，平均年龄(66.80±13.18)岁，健康志愿者6例，平均年龄(69.21±8.94)岁。AD患者均符合美国国立神经病、语言交流障碍和脑卒中研究所-AD及相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)中的AD诊断标准。研究通过大学道德伦理委员会的批准，所有患者签署知情同意书。

1.2材料 色谱级乙腈和水购自美国Sigma-Aldrich公司。硫磺素T购自日本东京化成公司。其他化学品购自北京索莱宝有限公司。

1.3方法

1.3.1乙腈沉淀血清蛋白质 将1 ml血清和1 ml乙腈混合并置于冰上1 h，以5 000 r/min离心5 min，分离上清。

1.3.2十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 将50 μg血清和上清液用于SDS-PAGE，用考马斯蓝染色，然后使用Quantity One v4.6.6分析。

1.3.3HPLC分离血清蛋白 将100 μl上清注入HPLC系统，该系统由Agilent 1260系列液相色谱仪组成，配备有四元泵和脱气装置，恒温自动进样器和柱室，多波长检测器和化学工作站软件。室温下在Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱上，通过线性乙腈梯度(50%～86%)洗脱，以1.0 ml/min的流速进行蛋白质的分离，洗脱时间为20 min。

1.3.4硫黄素(Th)T溶液测定淀粉样变程度 收集保留时间1.5～3.0 min，10.0～14.0 min的上清，使用冻干机(Christ alpha 1-4LD Plus)干燥，然后重悬于50 mmol/L甘氨酸-HCl缓冲液(pH3.0)中，在37℃孵育5 d。取50 μl加入200 μl 2 μmol/L ThT溶液(50 mmol/L Tris，pH7.4)中，使用F-380荧光光谱仪(天津港东有限公司)获得荧光光谱。ThT荧光发射波长为485 nm，激发波长为450 nm。每份样本均测定4次。

1.4统计学处理 用GraphPad Prism8.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1乙腈沉淀血清中高分子量蛋白 AD患者及健康志愿者乙腈沉淀后上清液蛋白强度低于沉淀前(见图1)，上清中保留了低分子量蛋白质。

2.2利用HPLC技术分析血清中低分子量蛋白谱系 HPLC保留时间1.1 min AD患者(11.73±1.04)与健康志愿者蛋白谱强度(10.25±1.73)未见明显差异(P>0.05)，在保留时间1.7 min，健康志愿者色谱峰强度(57.29±2.16)显著高于AD患者(19.638±1.12，P<0.05)，而在11.3 min，AD患者色谱峰强度(119.31±2.75)显著高于健康志愿者(44.84±1.84，P<0.05)。

2.3利用ThT测定AD患者血清上清淀粉样变的荧光强度 保留时间10.0～14.0 min的AD患者血清上清ThT荧光强度显著高于孵育前(P=0.000 4)，健康志愿者ThT荧光强度孵育前后无统计学差异(P>0.05)。见表1。

图1 乙腈沉淀血清蛋白前后SDS-PAGE考马斯亮蓝染色

表1 ThT测定血清上清淀粉样变的荧光强度

3 讨 论

目前AD临床检验共识项目是检测淀粉样变相关蛋白，而非病理性淀粉样变纤维成分，建立液体活检病理性淀粉样变纤维的方法，将有利于临床诊断。已经有大量报道，荧光探针ThT能够特异性与淀粉样变纤维结合，其荧光强度能够反映淀粉样变水平〔7～9〕。另外，最近有研究报道，人血清白蛋白能够抑制淀粉样变形成〔10〕，在机体内，这些血清高丰度蛋白干扰利用HPLC分析低丰度蛋白。

据研究报道，乙腈具有良好的降低血清球蛋白及清蛋白电荷特性〔11〕，可以降低血清中球蛋白比例，本实验结果提示血清中高分子量蛋白得到沉淀，也减少了血清清蛋白及球蛋白的比例。

本研究结果说明AD患者血清中存在病理性淀粉样变纤维成分；健康志愿者血清中不存在病理性淀粉样变成分。HPLC对于蛋白成分具有良好的分离效果，结合一定浓度标准品，能够进行定量分析。

综上，本研究首次报道利用乙腈沉淀人血清高丰度蛋白，HPLC分离病理性相关淀粉样变成分的分离条件，该方法为临床辅助检验AD患者血清淀粉样变纤维成分提供了一种方法。