三阴性乳腺癌患者新辅助化疗前后MCM7基因表达及临床意义

雷海

(德阳市人民医院乳腺外科，四川 德阳 618000)

微小染色体维持蛋白(MCM)是广泛存在的保守蛋白质，对真核细胞复制作用明显。MCM7是MCM 复合体之一，保证1个细胞周期中DNA复制1次〔1〕。MCM7功能异常可能会导致正常细胞增殖异常。MCM7基因会导致一些肿瘤的抑制因子表达，与肺癌、肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤的浸润、转移等生物学行为密切。目前国内外对MCM7有少数报道，主要集中在免疫组化检测方面。同时免疫组化和PCR两种方法在乳腺癌新辅助化疗前后变化的检测仍未见有报道。目前研究认为MCM7在乳腺癌的早期作用明显，在乳腺癌的化疗后表达如何仍未见有报道。MCM7蛋白及mRNA能否反映化疗效果，是否有潜在的靶向治疗意义仍没有答案，尤其对于三阴性乳腺癌。

三阴乳腺癌分化差，内分泌治疗和人表皮生长因子受体(HER)-2靶向治疗效果差，治疗手段单一，预后较差。三阴乳腺癌对化疗较为敏感〔2,3〕。以前对乳腺癌新辅助化疗(NAC)疗效的评定仅限于以化疗前后症状及体征来评定，很少有从乳腺癌分子机制对化疗疗效客观评价的报道。本研究通过检测三阴乳腺癌新辅助化疗前后MCM7 水平的变化情况，分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 2014年1月至2017年12月德阳市人民医院乳腺科52例Ⅱ～Ⅲ期三阴性初治乳腺癌女性病人〔4〕。年龄为36～62岁，中位49岁。TNM分期标准：Ⅱ期24例，Ⅲ期28例。血常规、肝肾功能检查、心电图均无明显异常。全部患者确诊前未接受过任何全身及局部治疗，Karnofsky 评分均>90分。入组条件：①术前患者均行粗针穿刺病检，确诊乳腺浸润性导管癌；②肿瘤大于3 cm，免疫组化雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和HER-2均为阴性，荧光原位杂交技术(FISH):无扩增。 ③患者均为初治乳腺癌患者，无内分泌治疗及放疗等任何治疗。 ④患者化疗前行肺部、肝脏等增强CT检查和骨扫描检查，无全身转移。

1.2新辅助化疗 52例患者术前NAC方案均采用TEC方案：第1天，予以多西他赛60 mg/m2(深圳万乐公司产品)，表柔比星 60 mg/m2(深圳万乐公司生产)；第2天，环磷酰胺 500 mg/m2，21 d为1个周期。6个化疗周期结束后行乳腺癌改良根治术。

1.3检测项目及方法

1.3.1标本及试剂 术前经14G空心活检针(BARD公司)穿刺组织及新辅助化疗后术中切取的组织标本作为检测标本。常规行组织的包埋石蜡、制片及组化检测。

浓缩型兔抗人MCM7单抗(美国abcam公司)，稀释浓度为1∶100。Trizol购自中国的碧云天公司，试剂盒(逆转录)购自Promega公司，荧光定量PCR试剂盒及引物合成均购自大连生物公司。

1.3.2免疫组化检测 免疫组织化学检查采用S-P两步法。 鼠抗人MCM7的单抗(浓缩型)购自abcam公司。整个过程按说明书进行。用已有阳性切片作为阳性的对照，阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)。 免疫组化参考Nishihara等〔5〕报道的标准，棕黄色细颗粒在细胞核内为MCM7阳性。随机选取5个阳性染色区利用Image J软件对阳性细胞率检测。使用Image J软件检测肿瘤组织平均的光密度，进行MCM7水平测定半定量。

1.3.3荧光定量的逆转录酶链聚合反应(RT-PCR) 组织匀浆：粉碎液氮后的标本，每50～100 mg标本加入1 ml TRIzol试剂，溶化匀浆。浆液常温置5 min，充分解离核酸及蛋白。每1 ml TRIzol匀浆液中加入0.2 ml氯仿，剧烈摇震15 s后静置2～3 min。4℃温度下10 000r/min离心10 min。取上层(无色)移到另试管中，算所取水相量。加入等体积异丙醇(预冷)。静置10 min，充分沉淀RNA。4℃ 10 000 r/min将其离心10 min。去清液，每管加1 ml 75%酒精去除残存的异丙醇。4℃温度7 500 r/min离心5 min。弃除上清液，沉淀干燥RNA。适量无核糖核酸酶(RNase)水溶解RNA沉淀。

盲选样行预先实验，确定反应条件。反转录和荧光PCR反应：取1 μg RNA行cDNA合成，取5 倍缓冲液 4 μl、引物1 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl、Rnasin 20 U、逆向M-MuIV逆转录酶(20 U/μl)1 μl，加焦碳酸二乙酯(DEPC)至20 μl，25℃ 10 min，42℃ 60 min，70℃ 10 min，逆转录合成cDNA。荧光定量PCR体系25 μl中含SYBR Green Mix 12.5 μl。制定定量反应溶解曲线和标准曲线，以内参GAPDH对MCM7 mRNA行定量检测。荧光定量PCR扩增条件的设置：94℃ 4 min；94℃ 20 min；60℃ 30 min；72℃ 30 min，循环35次，72℃时检测信号。拟定阈值为产物所达到的循环圈数即Ct值(定量结果)。分析每例标本的MCM7 mRNA表达水平。引物序列：MCM7F正义链：5'-TCCCTCGTAGTATCACGGTGC-3'，反义链：5'-ATGGGCTTCCAGGTAGGTTTC-3';(158 bp)；β-actin正义链：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'。反义链：5'-ACCACAGCCTCGCTCACG-3'(205 bp)。

1.4结果判定 NAC后的病灶变化按世卫组织(WHO)抗肿瘤药物客观疗效评定〔4〕进行。分别在NAC前及NAC后2个周期和4个周期及化疗结束后由临床及影像科的主治以上医师根据病灶变化认定效果。划分完全的缓解(CR)，部分的缓解(PR)，稳定状态(SD)，进展状态(PD)。CR+PR为临床病灶总缓解率。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验、χ2检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1病灶体积变化及组织学改变 新辅助化疗后2个周期：40例患者的肿块明显缩小，CR 3例，PR 37例，总缓解率为76.9%(40/52)。PD 1例,立即行乳腺癌手术。新辅助化疗后4个周期后43例患者的肿块明显缩小，CR 7例，PR 36例，总缓解率为87.8%(43/52)。新辅助化疗结束后47例患者的肿块缩小明显，CR 12例，PR 35例，总缓解率90.4%(47/52)，SD 4例，PD 1例。

30例术后标本肉眼显示癌组织边界较明显，切面多为灰白色，砂砾样。光镜下可见部分肿瘤细胞有坏死变性现象，部分胞质坏死凝固、细胞核皱缩。肿瘤区的管腔、血管变窄，有的甚至闭塞萎缩。镜下可见MCM7蛋白主要在细胞核，很少表达在细胞质，呈颗粒状。在癌旁正常组织未见表达。见图1。

图1 NAC前、后MCM7蛋白表达(S-P，×400)

2.2MCM7蛋白表达 新辅助化疗后MCM7蛋白明显表达低于化疗前(P<0.05)。CR+PR组化疗前MCM7蛋白表达比化疗后高，有显著差异(43.12±8.45 vs 21.87±6.17，P<0.05)，SD+PD组化疗前MCM7蛋白表达高于化疗后，但无显著差异(43.45±6.25 vs 37.41±5.81，P>0.05)。

2.3MCM7 mRNA表达 新辅助化疗前后MCM7 mRNA检测:52例患者新辅助化疗前后乳腺癌标本中的MCM7 mRNA表达分别为0.17±0.07和 0.12± 0.05。化疗后MCM7 mRNA的表达水平较化疗前低，但无统计学意义(P=0.062)。CR+PR组化疗前MCM7 mRNA表达高于化疗后，有显著差异(0.175±0.06 vs 0.109±0.07;P<0.05)，SD+PD组化疗前MCM7 mRNA表达高于化疗后，但无显著差异(0.164±0.05 vs 0.158±0.06；P>0.05)。

3 讨 论

三阴乳腺癌是乳腺癌的亚型。研究表明，三阴乳腺癌对化疗敏感性较其他亚型高〔3〕,新辅助化疗在三阴乳腺癌治疗中的效果更突出。三阴乳腺癌缺乏有效的分子治疗靶点，同时也与缺乏评估其治疗效果的特征性分子指标。因此，找出能真正反映三阴性乳腺癌化疗疗效的分子指标至关重要。

MCM7可以与其他MCM蛋白聚成多聚物，在调控DNA复制和延伸中有重要作用，同时与细胞周期的调控、转录、细胞增生、恶性肿瘤关系紧密〔6,7〕。此外MCM7蛋白还在一些抑癌及致癌信号通道中有关键作用，有研究提示MCM7蛋白在恶性肿瘤早期阶段有重要作用〔8,9〕。研究〔10,11〕表明，MCM7蛋白在霍奇金淋巴瘤、肺癌等多种恶性肿瘤细胞中均呈高表达，是一种判断癌细胞的生物学行为指标。本研究中发现MCM7蛋白主要表达在乳腺癌细胞核中，在正常腺体细胞中较少表达。表明MCM7是乳腺癌的特异性表达蛋白，对乳腺癌诊断有价值。也表明其可能是乳腺癌潜在的基因治疗靶点。研究表明〔12〕，MCM7在鼠、树鼩、人的肝癌组织中蛋白表达明显高于正常肝组织及癌旁中的表达水平，与本研究结果相同。

本研究免疫组化结果表明MCM7蛋白表达水平可成为简单有效判断新辅助疗效的病理指标。MCM7 mRNA检测和MCM7蛋白是相似的。表明MCM7蛋白能够替代MCM7 mRNA的检查反映MCM7基因的变化。Coli等〔13〕发现MCM7可为预测垂体腺癌复发及进展独立因素。Qu等〔14〕研究发现，原发性肝癌的预后与MCM7表达有关；通过敲除MCM7基因功能可以显著抑制肿瘤生长，激活MAPK信号，上调CyclinD1表达，促进肿瘤进展和转移。本实验表明新辅助化疗能明显缓解三阴乳腺癌患者病情进展，可能与抑制乳腺癌组织MCM7表达相关。MCM7对于判断乳腺癌的浸润、预后及转移意义重大，可能是乳腺癌的分级特异基因。

综上所述，在乳腺癌的发生及发展过程中，MCM7蛋白的高表达和三阴乳腺癌的进展相关密切，检测MCM7蛋白和MCM7 mRNA可作为判断新辅助化疗效果的生物学指标。MCM7蛋白可代替MCM7 mRNA反映MCM7基因的变化。由于MCM蛋白在三阴性乳腺癌细胞异常增殖调控中的重要作用，研究调控细胞MCM7蛋白表达有利于抗癌药物的靶向研究。