芦苇秸秆对灵芝液体发酵多糖产量的影响*

辛世纪，刘静雯，班立桐，黄 亮，王 玉，孙 宁

（天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384）

灵芝（Ganoderma lucidum），属多孔菌科（Polyporaceae） 灵芝属（Ganoderma），是常见的药用真菌。研究表明，灵芝多糖的原料来源主要有人工栽培和液态发酵2种，其中人工栽培仍是目前灵芝多糖提取原料的主要来源[1]。灵芝液体发酵可以获得灵芝的主要活性成分，同时液体发酵技术具有周期短、易操作、成本低、效益高等优点，且能够大大提高灵芝活性成分的产量[2]，得到了国内外研究学者的广泛关注[3-4]，对于灵芝工厂化生产更为有利。

灵芝多糖是灵芝最主要的活性成分之一，是一种活性很强、功能性齐全的天然糖类高分子化合物，是灵芝生长过程中奠基固本的重要因素之一，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基、抗病毒、功能性产品加工等价值[5-9]，具有更深层的开发潜力。

芦苇，为禾本科多年生草本植物，在我国出产很丰富，具有很强的净水能力，能够大量吸附氮、磷、铅、铬等元素，是一种能够创造巨大的生态价值和社会经济效益的纤维植物。目前芦苇在世界范围内主要用于医疗保健、畜牧业、建筑工业、造纸和人造棉[10-11]。尽管国内对芦苇的研究已经取得一定的进展，但目前芦苇种群发生了前所未有的消退现象[12]，芦苇资源的应用存在局限性。使用芦苇秸秆作为灵芝液体培养的碳源，优化灵芝液体培养液的配方及培养条件，根据发酵液的胞外多糖产量优化其发酵工艺。既解决了芦苇资源应用的局限性、秸秆废弃物污染环境的问题，又为灵芝多糖的生产提供了新的可能，为芦苇秸秆-灵芝液体发酵技术的开发提供了依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

灵芝菌株G8，保藏于天津农学院食用菌研发中心。

1.1.2 供试芦苇秸秆

芦苇秸秆，取自天津市蓟州区于桥水库前置库。

芦苇秸秆预处理方式：105℃杀青2 h后，放于80℃烘箱中烘干至恒重，自然冷却至室温后，用粉碎机粉碎，过60目筛，备用。

1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蛋白胨 3 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g、VB10.1 g，蒸馏水1 000 mL。

基础发酵培养基：葡萄糖30 g、蛋白胨10 g、KH2PO41.5 g、MgSO40.75 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

1.3 试验方法

1.3.1 高产多糖液体培养基配方单因素筛选

1）碳源筛选：基础发酵培养基（无葡萄糖）分别添加芦苇秸秆、玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆各5 g，以添加30 g葡萄糖为对照。摇床培养7 d，取样检测多糖产量，确定最适秸秆种类。

2）碳源添加量：将芦苇秸秆加入基础发酵培养基中，作为发酵液唯一碳源。以不加葡萄糖的基础发酵培养基为对照，芦苇秸杆在培养基中的配比分别设置为0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%。摇床培养7 d，取样检测多糖产量。

3）氮源筛选：基培发酵培养基（无蛋白胨）分别添加尿素6 g、硫酸铵7 g、硝酸铵4 g、酵母浸粉7 g，以添加10 g蛋白胨为对照，进行灵芝液体培养。摇床培养7 d，取样检测多糖产量。

4）氮源添加量：确定最佳氮源后，设置不同最佳氮源配比分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%。摇床培养7 d，取样检测多糖产量。

5）初始pH：最优培养条件在未发酵前调节发酵液pH，分别设置pH为3、4、5、6、7、8。

6）转速：在最优培养条件下设置摇床培养的不同转速，分别为 110 r·min-1、130 r·min-1、150 r·min-1、170 r·min-1、190 r·min-1。

7） 温度：设置不同培养温度，分别为23℃、25℃、27℃、29℃、31℃。

1.3.2 灵芝液体发酵胞外粗多糖产量测定方法

取摇床培养至第7天的发酵液为测定对象，检测灵芝胞外多糖产量。

发酵液过8层纱布，取过滤后的发酵液20 mL，4 000 r·min-1离心10 min。处理后的过滤液取5 mL于洁净干燥的离心管中，缓慢加入4倍体积的无水乙醇并搅拌均匀，于4℃静置醇沉24 h，每12小时摇匀。醇沉后将离心管置于6 000 r·min-1条件下离心8 min，倒去上清液，取沉淀。置于烘干箱中烘干至恒重，称重计算其多糖含量[13-14]。

1.3.3 高产多糖液体培养基配方正交试验设计

根据单因素筛选试验，确定以每升液体培养基中芦苇秸秆和硫酸铵的添加量及pH为因素，设计L9（33）的正交试验，正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平设计表Tab.1 Horizontal design of orthogonal test factors

2 结果与分析

2.1 高产灵芝多糖液体培养基单因素筛选试验

2.1.1 不同碳源对液体培养泰山灵芝多糖产量的影响

选用不同的秸秆作为碳源，对泰山灵芝液体培养生产多糖的影响见图1。

图1 不同碳源条件下灵芝液体培养多糖产量的比较Fig.1 Comparison of the yield of polysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different carbon sources

如图1所示，添加不同秸秆种类作为培养基碳源均对灵芝多糖产生有促进作用，且灵芝的多糖产量明显高于对照组；而添加芦苇秸秆的培养基中多糖产量大于添加其他种类秸秆的处理。多糖含量顺序依次为：芦苇秸秆（2.22 g·L-1）＞小麦秸秆（2.09 g·L-1）＞玉米秸秆（2.01 g·L-1）＞水稻秸秆（1.86 g·L-1）＞对照组（1.46 g·L-1）。因此，选择芦苇秸秆作为唯一碳源。

2.1.2 碳源配比对液体培养泰山灵芝多糖产量的影响

芦苇秸秆作为碳源，其不同配比对液体培养泰山灵芝多糖产量的影响见图2。

图2 不同芦苇秸秆添加量下灵芝液体培养多糖产量的比较Fig.2 Comparison of the yield of polysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different amounts of reed straw addition

如图2所示，液体培养泰山灵芝G8多糖产量最高的处理为添加0.5%芦苇秸秆，其次为添加3%芦苇秸秆；0.5%处理下多糖产量最多，达2.47 g·L-1，3%处理为2.31 g·L-1。由于碳源是作为灵芝生长的最主要营养成分，也是促进液体发酵时灵芝多糖产出的主要因素之一，故选择芦苇秸秆添加量为正交试验的因素。

2.1.3 不同氮源对液体培养泰山灵芝多糖产量的影响

使用不同氮源对液体培养泰山灵芝多糖产量的影响见图3。

图3 不同氮源条件下灵芝液体培养多糖产量的比较Fig.3 Comparison of the yield of polysaccharides produced by liquidcultivation of Ganoderma lucidum under different nitrogen sources

如图3所示，灵芝液体发酵条件对不同氮源的利用情况有较大差异。其中，酵母浸粉、硫酸铵的利用效果相对较高，蛋白胨、尿素的利用效果次之，硝酸铵利用效果最低。以硫酸铵为氮源的试验组多糖产量最大，为3.49 g·L-1。因此硫酸铵更有利于灵芝液体发酵时多糖的产生。

2.1.4 氮源配比对液体培养泰山灵芝多糖产量的影响

选用硫酸铵作为氮源，其不同配比对液体培养泰山灵芝多糖产量的影响见图4。

图4 不同硫酸铵添加量条件下灵芝液体培养多糖产量的比较Fig.4 Comparison of the yield of polysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different ammonia sulfate additions

如图4所示，随着氮源添加量的增大，灵芝发酵液的多糖产量呈现先增后减的趋势；配比为0.7%～1.3%时，多糖产量较大；其中，氮源配比为1%时多糖产量最大。在不同氮源添加量条件下，灵芝发酵的多糖产量各不相同，因此筛选合适的氮源添加量在提高灵芝发酵多糖产量上有较大的影响。因此，选择氮源添加量作为正交试验的因素之一。

2.1.5 不同初始pH对液体培养泰山灵芝多糖产量的影响

培养基不同初始pH对液体培养泰山灵芝多糖产量的影响见图5。

图5 不同初始pH条件下灵芝液体培养多糖产量的比较Fig.5 Comparison of theyieldofpolysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different initial pH conditions

如图5所示，随着pH的增大，多糖含量呈现先升高后降低的趋势；pH 7时多糖产量最大，为3.99 g·L-1。pH和溶解氧（DO） 是影响深层液态发酵灵芝菌丝体生长、代谢和灵芝多糖产生的重要因数，但目前对灵芝发酵过程中pH的研究都着眼于调节发酵初始pH，对发酵过程中的pH一般不作控制[15]。故选取初始pH作为正交试验的因素之一。

2.1.6 不同温度对液体培养泰山灵芝多糖产量的影响

不同培养温度对液体培养泰山灵芝多糖产量的影响见图6。

图6 不同温度条件下灵芝液体培养多糖产量的比较Fig.6 Comparison of theyieldofpolysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different temperature conditions

如图6所示，当温度为27℃时多糖产量最大，为3.92 g·L-1。有研究表明，灵芝液体发酵的最适温度为28℃[16]，可见最适温度与文献报道相近。因此，温度可以作为灵芝液体培养的稳定条件。

2.1.7 不同转速对液体培养泰山灵芝多糖产量的影响

液体摇瓶培养泰山灵芝时，不同转速对多糖产量的影响见图7。

图7 不同转速条件下灵芝液体培养多糖产量的比较Fig.7 Comparison of theyieldofpolysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different rotational speeds

由图7所示，当转速为170 r·min-1时多糖产量最大，为4.53 g·L-1。经分析该处理具有显著性差异。转速的变化可以改变溶氧和剪切力的变化，剪切力过大或溶氧不足都会对菌丝体的生长造成不良影响；适当提高转速能够增大发酵过程中的溶氧性，有利于灵芝产糖的积累[17]。转速不宜过高或过低，因此为达到稳定的培养条件，选择170 r·min-1转速为灵芝液体培养条件。

2.2 正交试验结果分析

正交试验结果分析见表2。

表2 正交试验结果Tab.2 Analysis of orthogonal test results

由表2可知，最佳的培养基配方为A1B3C3；即每升液体培养基中芦苇秸秆的添加量为10 g，其配比为0.3%，每升液体培养基中硫酸铵的添加量为13 g，其配比为1.3%，pH为8。最佳配方为试验中第2组组合，该组合处理下多糖产量为10.8 g·L-1，明显高于其他各组；且其菌丝球小而紧密，分布均匀。

灵芝液体发酵过程中的主要营养物质包含碳源、氮源、矿物质、维生素等，其中碳源是构成细胞物质的基本元素，为灵芝生长发育产生活性物质提供基本能量[18]。芦苇秸秆作为一种复合有机物质，不仅为灵芝液体发酵提供生长所需的碳源，也为灵芝液体发酵提供其他所需的营养物质。低转速培养时，产生的低剪切力会影响发酵液混合以及氧传递，导致溶氧量降低，从而使发酵效果降低[19]，影响灵芝多糖的产出；而加入芦苇秸秆可以使发酵液粘稠、充满颗粒感，进而使摇瓶中的剪切力、溶氧性大大增加，与基础培养基相比，菌丝产多糖量显著提高。除此之外，氮源也是作为灵芝菌丝体生长的必要元素，通过单因素试验发现，液体培养中对氨源的选择有较大差异，其中添加硫酸铵作为氮源的是灵芝发酵液及糖含量最高，因此选择硫酸铵作为灵芝液体发酵的氮源，并通过调节硫酸铵的添加量来筛选最适宜灵芝液体发酵的培养基氮源。

正交试验方差分析结果见表3。

表3 正交试验方差分析表Tab.3 Analysis of variance of orthogonal test

如表3所示，芦苇秸秆添加量对液体培养灵芝的多糖产量无显著性差异，但硫酸铵添加量和培养基初始pH对多糖产量具有极显著差异。

2.3 验证试验结果分析

对正交试验筛选出的组合进行验证，验证试验结果见图8。

图8 验证试验结果对比Fig.8 Comparison of verification test results

如图8所示，在A1B3C3组合条件下培养的菌丝体胞外多糖含量为10.82 g·L-1，与正交试验结果相近，误差不超过2%，具有良好的重现性。验证结果较优化前的基础液体培养基比，多糖含量有明显提高，提高4.41倍。

3 结论与讨论

报道的研究中，灵芝液体发酵的碳源、氮源以及pH对灵芝液体发酵胞外多糖的产出均有重要意义。不同pH对灵芝菌丝体的生长发育和多糖产出有不同的影响；验证试验结果显示，pH为8时多糖产量最大，这与刘冬等[15]多糖含量最佳pH为5.6的结果不同；但在基础培养基初始pH＞5.6时，多糖产量虽微低于pH 8时的产量，但均会趋于一个稳定的数值，出现这种差异可能是由于芦苇秸秆的理化性质引起。另有报道pH影响多糖的提取，在碱性条件下可更充分地提取多糖[20]。

首次将芦苇秸秆作为液体发酵液的变化成分，控制其他参数（包括培养温度、培养时间、接种量等） 不变，以提高胞外多糖产量为目标，通过正交试验优化灵芝液体发酵液的配方发酵条件，优化灵芝液体发酵工艺。结果表明，在液体培养基中芦苇秸杆配比为0.3%、硫酸铵配比为1.3%、pH 8、转速170 r·min-1、温度27℃的条件下，液体发酵灵芝的胞外多糖产量最高，为10.82 g·L-1；相比基础培养基优化效果明显，较优化前提高了4.41倍；且试验具有较好的重复性。另外，添加芦苇秸秆发酵出的菌丝体形状相比基础培养液发酵出的菌丝体更紧实、细密，利用其作为原种进行栽培后可以正常出芝。该试验的结果为芦苇秸秆资源利用及灵芝液体发酵工业化生产提供了理论依据和试验指导。