长根菇优良菌株评价与筛选*

王 月，任梓铭，于延申

（吉林省蔬菜花卉科学研究院，吉林 长春 130000）

长根菇[Hymenopellis raphanipes（Berk.）R.H.Petersen]隶属于担子菌门（Basidiomycota） 伞菌纲（Agaricomycetes） 伞菌目 （Agaricales） 膨瑚菌科（Physalacriaceae） 小奥德蘑属 （Hymenopellis）[1]，又名长根小奥德蘑、露水鸡地从[2]等，俗称“黑皮鸡地从菌”，是新近商业化栽培的热点食用菌[3]。该菌曾被误认作长根奥德蘑（Oudemansiella radicata）、鳞柄小奥德蘑 （Oudemansiella furfuracea） 及鸡地从菌（Termitomyces albuminosus），Hao等[4]2016年将该菌认定为卵孢小奥德蘑（Oudemansiella raphanipes），分类学研究中将其归为小奥德蘑属（Hymenopellis）[5]。

长根菇味道鲜美，营养价值高，具有预防种瘤、抑制幽门螺旋杆菌等作用[6]，子实体中含有的长根菇素（Oudenone）具有一定的降血压作用[7]，深受消费者喜爱。目前，对长根菇优良菌株筛选的报道较少，因此，从全国范围内收集了8个长根菇栽培菌株，对菌株进行ITS序列测定并构建系统发育树，明确其种源信息，排除同物异名现象。通过考察记录子实体形态和农艺性状，对长根菇菌株进行评价，同时筛选出适合吉林省栽培、具有品种改良价值的优质菌株，为长根菇育种提供资源储备。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

8个供试长根菇菌株分别命名为HYA、HYB、HYC、HYE、HYF、HYG、HYH、HYI，其来源详见表1。

表1 供试菌株来源Tab.1 The source of the tested strains

1.1.2 培养基

母种培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH自然。液体菌种培养基：1 L液体培养基加豆柏粉 7 g、葡萄糖 20 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、维生素B112 mg、消泡剂（C2H6OSi乳液）0.2 mL～0.4 mL、轻质碳酸钙适量，pH调整至约6.5，加水至1 L。栽培种培养基：棉籽壳20%、木屑44%、玉米芯20%、麦麸15%、石灰1%。

1.2 试验方法

1.2.1 分子生物学鉴定

1） 基因组DNA提取

无菌条件下，刮取PDA平板上的新鲜菌丝作为试验材料，以DNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）提取基因组DNA。

式中，yi为实验结果；n为实验次数；m为目标值。在某些特例下，钛合金介观尺度铣削表面粗糙度倾向于望目特性或望大特性。例如，生物医用材料表面粗糙度影响细胞黏附，各局部区域表面粗糙度需要控制在一定的范围内，并非越小越好。除此之外，对于零件表面粗糙度期望往往倾向于更小，符合望小特性。本文的优化目标是使各区域铣削表面粗糙度趋向于更小，各铣削区域表面粗糙度测量结果和信噪比计算结果如表5所示。

2） ITS序列扩增

引物选择真菌ITS通用引物ITS1和ITS4，PCR反应体系50 μL：2×PCR反应混合物25 μL，引物（0.2 μmol·L-1）各1.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 21 μL。在PCR仪上扩增，程序设定为：94℃预变性3 min；94℃变性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30个循环；循环结束后72℃延伸8 min。

3）ITS序列测定、比对及系统发育树构建

纯化后的PCR扩增产物和引物，由吉林省库美生物科技有限公司进行测序。测序结果利用BLAST在线比对工具进行比对，使用MEGA 6.0软件进行系统发育分析，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.2.2 拮抗试验

在灭菌的超净工作台上，用母种培养基倒平板，至培养基完全铺满整个培养皿，厚度不宜过大，以方便后期试验观察。将制备好的培养基平板底部划分为2块区域，并随机组合2个不同编号的菌株，用无菌操作接种技术，将对应编号的菌株接种于相应区域中央，使其相距2 cm～3 cm，做好标记并封口，后将平板置于25℃恒温培养箱中避光培养，待平板长满菌丝后，观察菌株间的拮抗情况。

1.2.3 菌丝生长情况比较

在灭好菌的超净工作台中，使用母种培养基倒平板，采用无菌操作打孔接种技术，用7 mm的灭菌打孔器取相同菌龄的供试菌株，接种于培养基平板中央，每组3个重复，做好标记并封口。将接种好的平板置于25℃恒温培养箱中避光培养，采用“十”字交叉法，每24小时测定菌丝生长速度，观察菌丝生长情况。菌丝平均生长速度（V，mm·d-1）的计算公式为：

式中：D表示菌落直径（mm）；d表示培养天数（d）。

按照配方备料，原材料用清水预湿处理12 h～24 h后，将各种原料加水充分搅拌均匀，培养料含水量60%～65%，pH 6.0～7.0。菌袋用17 cm×33 cm×0.03 cm的高密度低压聚乙烯塑料袋，装料松紧适度、均匀一致（每袋湿料1.2 kg）。常压灭菌4 h，当料内温度达100℃后，保持恒温15 h～20 h。灭菌后的料袋放入事先用气雾消毒剂熏蒸好的接种室，待料温降至30℃以下后，在超净台内接种。试验采用完全随机区组设计，每个菌株设3个重复，每个重复设长3 m、宽1 m、深20 cm的畦床，畦间留50 cm～60 cm的操作道。将菌袋脱去塑料袋，直立排放在畦内，细土粒填满空隙，上面覆盖4 cm～5 cm的土壤。出菇管理参照参考文献[8]。

1.2.5 测定指标

在长根菇整个生育期，调查菌丝至子实体阶段共15个农艺性状，性状指标及调查方法参照NY/T 3715-2020植物品种特异性（可区别性）、一致性和稳定性测试指南 长根菇[9]，详见表2。

表2 供试菌株农艺性状测定方法Tab.2 Assay methods of agronomic traits of tested strains

1.2.6 数据分析

采用Excel 2010做基本数据记录和处理，计算每个性状的变异系数（coefficient of variation，CV），根据所得结果分析各性状的遗传差异程度。

2 结果与分析

2.1 分子鉴定结果

测序结果使用BLAST在线比对工具进行序列分析，当与已知序列相似性≥99%时，即可判定为同一物种，8株长根菇的系统发育关系见图1。

图1 基于ITS rDNA序列的NJ系统发育树Fig.1 NJ phylogentic tree based on rDNA ITS sequence

由图1结果显示，所测8个样品均为长根菇。从GenBank数据库下载Hymenopellis属多个种的ITS序列，选择Psathyrella candolleana（Fr.）Maire作为外类群，使用MEGA 6.0软件进行系统发育分析，采用NJ法构建系统发育树。供试的8个菌株与下载的Hymenopellis属序列聚成一类，黄白小脆柄菇（Psathyrella candolleana） 单独为一个分支，其中HYA、HYB、HYG、HYF、HYC、HYE 6株菌株亲缘关系相对较近，与HYH、HYI亲缘关系相对较远，HYA与HYI亲缘关系最远。

2.2 拮抗试验

将8个菌株两两随机组合，无菌操作打孔接种于平板中，25℃下恒温暗光培养，观察菌株拮抗反应，其结果见表3。

表3 供试长根菇菌株拮抗反应结果Tab.3 Antagonistic test results of Hymenopellis raphanipes

由表3结果显示，28个组合中有15组有拮抗反应，HYI与其余7个菌株均有拮抗反应，HYF、HYG和HYH均与HYC、HYE有拮抗反应，HYE与HYC有拮抗反应，HYC与HYB有拮抗反应。

2.3 菌丝生长情况比较

结合拮抗反应结果和系统发育分析，排除同物异名菌株，选择HYC、HYE、HYH、HYI进行菌丝生长情况比较和农艺性状比较试验，比较不同菌株在PDA培养基上及菌袋中菌丝生长速度，结果见表4。

表4 供试长根菇菌株菌丝生长情况Tab.4 Mycelial growth situation of Hymenopellis raphanipes

由表4可知，不同菌株的菌丝生长速度不同，但在0.05和0.01水平上差异均不显著。菌丝的浓密程度有差异，其中HYE菌丝长势最好，且栽培种满袋时间最短，仅需30 d，HYH菌丝生长速度最慢，满袋时间需40 d。

2.4 子实体形态特征比较

按照1.2.5调查方法对4株长根菇菌株子实体阶段形态特征进行比较，对菌盖颜色、茸毛密度、菌盖直径和厚度、菌柄长度和直径等性状进行记录，结果见表5。

表5 供试长根菇菌株子实体形态特征比较Tab.5 Fruit body morphology of Hymenopellis raphanipes

由表5中数据可知，不同菌株菌柄形状及颜色差异不大，均为柱状，深褐色。菌株HYH菌盖呈中等褐色，HYC、HYE、HYI菌盖均为深褐色。菌盖直径、菌盖厚度、菌柄长度、菌柄直径性状内存在不同程度的遗传变异，其中以菌盖直径的变异最为广泛，变异系数范围为0.08～0.16。

2.5 农艺性状分析

试验选择菌株的农艺性状分析结果见表6。

表6 供试长根菇菌株农艺性状比较Tab.6 Agronomic trait of Hymenopellis raphanipes

由表6可知，不同菌株原基出现的时间不同，HYE最早出现原基，为33 d；HYI原基分化最迟，为46 d。HYC、HYE子实体形成最快，仅需3 d，与最慢的HYH菌株相差2 d。HYE单位面积产量最高，HYC次之，HYI单位面积产量最低。HYI平均单菇重最高，HYE次之，HYC平均单菇重最低，由单位面积产量及平均单菇重数据比较可知，二者间无直接相关性。HYE生物学效率最高，可达63.6%，HYC次之，HYI生物学效率最低，仅为37.3%。在数据调查中发现，HYI第三潮菇产量约为第一潮的三分之一，出菇后期菌丝活力明显减弱。

3 讨论

菌丝生长阶段，各菌株菌丝生长速度差异不显著，但HYE菌丝长势最强，栽培种满袋时间最短。出菇阶段，供试的4株菌株子实体形态差异不大，HYI子实体平均单菇重最大，但出现原基时间最迟，生物学效率最低。HYE最早出现原基，且单位面积产量最高，菌盖及菌柄紧实度偏硬，易于存储和运输，筛选出HYE为优良菌株，可进一步在吉林省推广栽培。

HYI虽原基出现最迟，单位面积产量最低，但子实体平均单菇重最高，HYC在母种培养基上菌丝长速最快，子实体形成时间最短，但平均单菇重最低。结合系统发育结果，HYI与HYC亲缘关系最远，在今后的育种工作中，可将HYC与HYI菌株作为品种改良的亲本，以培育出性状更加优良的长根菇菌株。