一株分泌型铁载体真菌分离鉴定及生物活性研究

邹雪峰 李铭刚 包玲风 陈齐斌 赵江源 汪林 濮永瑜郝大程 张庆 杨佩文

（1. 云南农业大学植物保护学院，昆明 650201；2. 云南大学云南省微生物研究所，昆明650091；3. 云南省烟草公司保山市公司，保山 678000；4. 大连交通大学环境化工学院/生物技术研究所，大连 116028；5. 云南省农业科学院农业环境资源研究所，昆明 650205）

云南省国家自然保护区哀牢山原始森林地处青藏高原东南部、著名的横断山脉纵谷地带，东亚季风气候、青藏高原季风气候和南亚东南亚热带季气候在此汇集，特殊的地形-气候-水文特征的耦合，土壤有机制质含量丰富，蕴藏丰富的具有重大经济价值的物种和种质资源［1］。从对土壤微生物分离、筛选和拮抗实验结果看，该区域原始森林土壤环境贮藏丰富的产铁载体微生物资源，值得进行深入发掘与利用［2］。铁离子是生物生命活动中的重要元素成分，在生化代谢反应和电子传递等生命活动过程中发挥重要作用。土壤中铁含量丰富，但主要以Fe3+形式存在，其氧化物或氢氧化物的溶解性极低，使铁的生物有效性大大降低［3］。土壤微生物则可以通过合成和分泌对三价铁离子具有高亲和力的小分子化合物铁载体来螯合自然界或宿主细胞中的铁，以满足自身生命活动需求。铁载体微生物作为一种特殊的宝贵资源，与农业可持续发展的关系十分密切，在土壤肥力的提高与保持、营养元素的转化、作物病害防控、环境净化与生态系统的平衡等方面起着极其重要的作用，是微生物肥料、微生物农药、微生物食品、微生物饲料、环境激素和环境工程微生物等创新药物或环保制剂研究与开发利用的重要基础［4］。随着研究的深入，很多结果表明多数微生物能合成至少一种铁载体，目前为止已发现500多种不同类型的铁载体，其中270个已被结构表征［5］。利用微生物分泌的铁载体是开发新型补铁剂及补铁添加剂，提高铁素利用率的主要措施，但目前认识较清楚的铁载体的数量还很有限，还有很多铁载体，尤其是能更好地反映菌株特异性的次级铁载体，有待进一步发现和研究［6］。

原始森林独特的生理生化环境中形成的微生物菌群，与来自土壤、海洋、植物等环境中的微生物菌群具有明显不同的生理生化特征，在生物学和功能活性方面表现出特异性和多样性。基于哀牢山原始森林独特的生态环境，开展铁载体微生物资源发掘与利用研究，将为铁载体研究提供必要的物种、遗传和生理生化功能信息。本文对从哀牢山原始森林土壤环境中分离到的1株分泌型铁载体真菌进行形态学和分子生物学鉴定，并研究其代谢产物对罹烟草青枯病土壤微生物生理生化功能的影响，以期为该菌株的开发利用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 采样区概况 本研究的分泌型铁载体真菌从云南省哀牢山国家级自然保护区森林土壤（100°49′-101°53′ E，23°95′-24°17′ N，海拔 780 m）中分离，该地区属于亚热带季风气候，年均气温18.9-22.6℃，降雨量2 200 mm。0-20 cm土壤有机质含量47.58 g/kg、含水量9.60%、铁元素质量含量1.18%、pH 6.47。

罹烟草青枯病根际土壤采自云南省保山市昌宁县大田坝镇，烟草种植基地（98°32′-99°63′ E、24°92′-23°43′ N，海拔 2 000 m），亚热带季风气候，年均气温15-17℃，年均降雨量1 290 mm。0-20 cm土壤有机质含量28.54 g/kg、速效氮134 mg/kg、速效磷27 mg/kg、速效钾167 mg/kg、pH 4.71。

1.1.2 供试溶液及培养基的制备 本研究所需的CAS检测液，取0.0605 g铬天青S（chromeazurol S，CAS）溶于50 mL去离子水中，并加入10 mL FeCl3溶液搅拌混匀，标记为“A液”；再称取0.072 9 g十六烷基三甲基溴化铵溶于40 mL去离子水，标记为“B液”；最后将A液缓慢倒入B液中，并搅拌均匀。1-5F1菌株菌悬液，菌株斜面试管中加入2 mL无菌水，刮取菌苔，用酶标仪或分光光度计测试其在OD625处读取1的吸收值。将1-5F1菌株代谢物配制成0.05、0.15、0.45 mg/mL浓度的溶液备用。PDA培养基、无铁查氏液体培养基、双层显色培养基的配制与Retamal-Morales等［7］的研究相同。

1.1.3 土壤样品采集、处理 2017年采集的森林土壤样品与2020年采集的烟草青枯病根际土壤样品，两个样品分别在不同的采样区采集，按照常规取样法在采样区域对角线5点取样，然后混合均匀为1个样，挑除根系等杂质后迅速放入做好标记的自封袋中，带回实验室置于4℃低温冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 菌株产铁载体活性测定 对土壤样品中分离到的菌株进行编号，对培养完成的单菌落用菌饼器取菌饼（直径6 μm），接种在双层显色培养基的中心上层，每菌株3重复。将完成接种的培养基放置在25℃恒温培养基中培养7 d，观察显色层颜色变化。

挑选出培养基底层颜色变红的菌株，加入到无铁查氏液体培养基中，后在28℃、150 r/min的恒温摇床（型号：HS-200B）上培养48 h，培养结束后吸取2-5 mL培养液用0.22 μm无菌滤膜过滤后加入等体积的CAS检测液，静置1 h后用全波长酶标仪（型号：Multiska GO）测定其 OD630（记作“As”），用相同方法测定未接菌的液体培养基的OD630作为参比值（记作“Ar”）。铁载体的浓度用铁载体活性单位（siderophore unit，SU）表示，SU（%）=［（Ar-As）/Ar］×100%，测定重复3次，取平均值进行比较分析。

1.2.2 菌株产铁载体类型判定 在1 mL菌株培养滤液中加入1 mL浓度为0.25 μmol/L的CuSO4溶液和1 mL（pH 4.0）醋酸盐缓冲液，用紫外分光光度计检测。在190-280 nm之间出现吸收峰则说明螯合物为羧酸型（carboxylates）铁载体。

1.2.3 菌株的形态学与分子生物学鉴定 观察单个菌株在PDA平板培养基的形态，使用双面刀片切下菌落（3 mm×3 mm），然后使用1%戊二醛固定30 min，蒸馏水清洗2次（20 min/次），采用不同浓度乙醇（50%、70%、80%、90%、100%）与丁叔醇（75%、100%）进行脱水15 min/次，置冰箱冷冻室固化，抽真空升华干燥，扫描电镜观察。

采用ITS-rDNA通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行 PCR 扩增 ；反应体系 ：3.0 μL 10×Buffer、2.5 μL dNTP（2.5 mmol/L）、1.0 μL MgCl2（25 mmol/L）、1.0 μL DNA、1.0 μL ITS1（10 μmol/L）、1.0 μL ITS4（10 μmol/L）、1.0 μL Taq 酶（2.5 U/μL）、0.5 μL ddH2O；PCR 反应条件 ：94℃预变性 5 min，94℃变性 1 min，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，50个循环反应，循环后72℃延伸10 min，4℃保存，与Tistechok等［8］的相同，系统发育分析时排除碱基缺失位点，采用邻接（neighbor-joining，NJ）法，用MEGA7构建供试菌株与参比菌株之间的系统发育树。

1.2.4 提取菌株代谢物及罹烟草青枯病根际土壤处理 选择25 g蒸熟大米装入到500 mL组培瓶中，进行高压蒸汽灭菌（121℃、30 min），然后加入1 mL菌悬液，充分搅拌，放入37℃恒温培养箱，静置培养1-2月。完成发酵后在发酵瓶中加入95%的甲醇充分浸泡24 h，选择5 mm孔径滤纸过滤。旋转蒸发仪（R-210 BUCHI）温度设置45℃，转数700 r/min，将滤液中有机溶剂完全蒸发。

选择烟草青枯病根际鲜土样，称取30 g土样倒入50 mL的离心管中，加入5 mL蒸馏水静置5 min，再添加不同浓度的菌株代谢物。其中设置对照组CKA（病土加5 mL蒸馏水）与处理组（加5 mL菌株代谢物），在0.05 mg/mL浓度下标记为1-5F1A，0.15 mg/mL为1-5F1B，0.45 mg/mL为1-5F1C。

1.2.5 处理土壤蔗糖酶与脲酶活性及土壤Biolog测定新鲜土样冷冻干燥，先粗研磨，过40目筛网，再次研磨过60目筛网。分别称取0.1 g和0.2 g土壤样本，采用DNS比色法［9］测定土壤蔗糖酶（S-SC）与脲酶（S-UE）。选择苏州格瑞思生物科技有限公司试剂盒，加对应的试剂在37℃水浴锅中孵育，完成后土壤蔗糖酶在OD540与脲酶在OD578读取吸光度值。土壤蔗糖酶活力（mg/d/g）=2.2×（△A+0.0445）/W×D，脲 酶 活 力（mg/d/g）=27.6×（△A+0.0051）/W。△A=A测定管-A对照管，W为土壤样本实际称取量，D为稀释倍数。

采用Biolog-GN板来确定供试土壤微生物群落水平的生理分布，接种液的制备采用王雪梅等［10］的方法，接种后的ECO板在25℃条件下连续培养10 d，每隔24 h用酶标仪在OD595处读数。

1.2.6 数据处理 土壤微生物群落利用碳源的整体能力用平均颜色变化率（average well color development，AWCD）表示，土壤微生物群落功能多样性指数包括Shannon指数、Simpson指数、Richness指数，各指数计算方法与Ge等［11］相同，数据采用SPSS进行方差分析。

2 结果

2.1 产铁载体活性菌株分离

本研究在云南省哀牢山森林土壤中分离到100多株菌株，经过产铁载体活性测定得到一株高产铁载体活性菌株并编号为1-5F1。由PDA平板培养得到菌落形态（图1-A）为圆形，棕黄色。通过双层显色培养基培养（图1-B）底层颜色由蓝色变为红色，表示菌株能产生螯铁离子的铁载体。通过对1-5F1菌株产铁载体活力值定量分析，得出1-5F1菌株产铁载体活性单位（SU）为78.79%，相比本研究其他菌株的铁载体活性都要高。

图1 菌株平板培养（PDA与CAS平板）Fig.1 Plate culture of the strain（PDA and CAS plate）

2.2 铁载体类型判定

通过使用分光光度计（EU-2200R）全波段扫描后发现（图2），含有1-5F1菌株分泌铁载体的培养滤液只在190-280 nm波段下出现最高吸收峰，故判定1-5F1菌株所产的铁载体为羧酸型（carboxylates）。

图2 1-5F1菌株产铁载体在全波段下吸光度值Fig.2 Absorbance values of strain 1-5F1 siderophores in full band

2.3 菌株鉴定

通过扫描电镜观察（图3），1-5F1菌株分生孢子间隔紧密，圆形，直径在3.5-4 μm，分生孢子表面有平滑。在形态观察基础上，使用分子生物学方法扩增菌株的ITS序列。结果表明，1-5F1菌株ITS扩增序列在GenBank数据库中进行相似性搜索，并与同源性高于80%的标准菌株序列进行同源比对（图4），1-5F1菌株与百岁兰曲霉（Aspergillus welwitschiae）同源性高达99.97%，故将1-5F1菌株鉴定为百岁兰曲霉菌。

图3 菌株分生孢子电镜形态Fig.3 Microscopic morphologies of conidia of the strain

图4 菌株1-5F1基于ITS基因序列构建的系统发育进化树Fig.4 Phylogenetic tree of strain 1-5F1 based on ITS gene sequence

2.4 菌株代谢物对罹病土壤酶活力影响

土壤蔗糖酶与脲酶活力值一定程度上反映土壤微生物群落对碳和氮元素转化能力，酶活力值越高土壤转化能力越强。由图5所示，与未施加的土壤相比，施加1-5F1菌株代谢物的土壤蔗糖酶与脲酶活力值高（P＜0.05）。在1-5F1菌株代谢物各浓度间对比下，土壤蔗糖酶与脲酶活力值均较高时对应的浓度为0.15 mg/mL。因此可见，随着代谢物浓度增加，土壤蔗糖酶与脲酶活力值均呈现先增加后下降的情况，最适浓度为0.15 mg/mL。结果说明最适浓度的1-5F1菌株代谢物能够显著提高烟草青枯病土壤微生物对碳与氮源的利用。

图5 1-5F1菌株代谢物对烟草青枯病根际土壤蔗糖酶（SSC）与脲酶（S-UE）活力的影响Fig.5 Effects of metabolites of 1-5F1 strain on the activities of sucrase（S-SC）and urease（S-UE）in the rhizosphere soil of tobacco bacterial wilt

2.5 菌株代谢物对罹病土壤碳源利用强度的影响

AWCD一定程度上可反应土壤微生物种群数量与群落的生理功能多样性，平均颜色变化率值越大表明土壤微生物利用单一碳源能力越强，微生物活性也越高。由图6所示，随着培养时间的延长施加1-5F1菌株代谢物的土壤AWCD逐渐升高，未施加菌株代谢物的土壤总体趋向于平缓。在48-144 h时间段中，施加菌株代谢物的土壤AWCD曲线斜率最大，表明这一阶段土壤微生物碳源代谢活性最高。在培养196 h后AWCD曲线趋向平缓，各处理间AWCD 表现为 ：1-5F1B＞1-5F1C＞1-5F1A＞CKA＞CKB。结果表明，与未施加相比，施加1-5F1菌株代谢物可显著提高土壤AWCD。

图6 1-5F1菌株代谢物对烟草青枯病根际土壤平均颜色变化率（AWCD）随时间的变化Fig.6 Mean color change rate（AWCD）of tobacco bacterial wilt rhizosphere soil treated by the metabolites of 1-5F1 strain with time

在各土壤处理下土壤微生物对主要碳源的优先利用种类和程度也有显著差异。由图7所示，与未施加1-5F1菌株代谢物相比，施加菌株代谢物的土壤对氨基酸，碳水化合物，多聚化合物，芳香化合物和羧酸类化合物的利用能力更强（P＜0.05）。随着浓度的提高土壤对各碳源利用的AWCD表现为1-5F1B＞1-5F1C＞1-5F1A。以上均表明，受1-5F1菌株代谢物的影响烟草青枯病土微生物群落对碳源利用能力显著增强，但随着菌株代谢物浓度不断提高病土微生物群落对碳利用能力出现先增加后降低的趋势。

图7 菌株不同浓度代谢物处理下土壤微生物群落对碳源利用能力的差异Fig.7 Differences in carbon source utilization abilities of soil microbial communities treated with different concentrations of metabolites of bacterial strains

2.6 菌株代谢物对罹病土壤微生物群落功能多样性影响

采用Shannon指数、Simpson指数、Richness指数综合表征了土壤微生物群落中功能的多样性、分布的均匀度和丰富度。由图8所示，随着培养时间的延长Simpson指数在各处理下变化不显著（P＞0.05），对于Shannon与Richness指数，当培养到196 h时各指数差值最大，表现为1-5F1B＞1-5F1C＞1-5F1A＞CKB＞CKA（P＜0.05）。与未施加 1-5F1菌株代谢物的土壤相比，施加菌株代谢物的土壤微生物群落功能多样性与丰富度显著提高。但随着菌株代谢浓度的增加Shannon与Richness指数的变化与土壤AWCD指数一致，在1-5F1B处理下最高。结果说明，1-5F1菌株代谢物对烟草青枯病土壤微生物群落功能多样性与丰富度具有促进作用。

图8 菌株不同浓度代谢物处理下土壤微生物功能多样性指数随时间的变化Fig.8 Changes in soil microbial functional diversity index with time under different concentrations of metabolites from the strain

3 讨论

大多由嗜铁菌分泌的铁载体可特异性螯合铁离子，且被吸收的铁离子又在菌株各项机能代谢过程中发挥着重要作用［12］。通过微生物对土壤环境中铁离子的争夺，可有效的改变土壤微生物群落结构［13-14］。在自然中存在大量可分泌铁载体的微生物，其中已报道的真菌有曲霉属Aspergillus［15］、青霉属 Penicillium［16］、链格孢属 Alternaria［17］、木霉属 Trichoderma［18］、白僵菌属 Beauveria［19］均可分泌铁载体。本研究，通过对云南省哀牢山森林土壤中大量菌株筛选，获得一株高产铁载体活性的菌株（1-5F1）。对1-5F1菌株进行形态学与分子生物鉴定得出，该菌株与百岁兰曲霉菌相似度最高。根据文献报道，曲霉属中可分泌铁载体的有黄曲霉Aspergillus flavus［20］、黑曲霉 Aspergillus niger［21］、赭曲 霉 Aspergillus ochraceous［22］、 烟 曲 霉 Aspergillus fumigatus［23］，但相比1-5F1菌株（载体活性单位SU为78.79%）产铁载体活性较低。通过测定菌株代谢物全波段吸收峰，对铁载体化学结构进行初步鉴定。结果表明，菌株所产铁载体类型为羧酸型。有研究指出，真菌主要合成分泌异羟肟酸型和羧酸型铁载体［24］，与本结果相符合。在云南省哀牢山森林土壤中发现的百岁兰曲霉菌，具有分泌铁载体的能力系为首次报道。对自然界中嗜铁菌株的发掘可为后续菌株的利用提供基础。

根际作为植物-土壤-微生物相互作用的关键微域，每克根际土壤中大约有109个微生物定殖，其中土传病害的发生主要依靠关键微域的相互作用［25］。烟草青枯病作为土传病害，由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）从烟草根际侵入，引起植株发病［26］。有学者研究发现，在烟草青枯病根际土壤中主要存在的微生物类群有真菌的子囊菌门、接合菌门、担子菌门和壶菌门，细菌的变形菌门、放线菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门［27-28］。本研究将嗜铁菌代谢物与烟草青枯病根际土壤微生物学特性相结合。通过之前分离到的嗜铁菌（1-5F1），将其发酵处理提取菌株代谢物，施加到烟草青枯病根际土壤中，后进行240 h培养测定土壤中蔗糖酶与脲酶的活性，并对土壤进行Biolog分析与微生物功能多样性分析。施加菌株代谢物的土壤蔗糖酶与脲酶活性显著增强，说明受到菌株代谢物（含有铁载体）的影响烟草青枯病根际土壤中微生物群落提高对碳和氮的利用能力。这一研究结果与Voβ等［29］相似，菌株代谢物（含有铁载体）可促进土壤中微生物群落变得更为活跃。一方面的原因可能是微生物群落中存在特定的类群可利用施加的菌株代谢物促进自身的发展，另一方面的原因这种菌株代谢物可抑制土壤微生物群落中优势菌群的生长。

Biolog法是通过微生物对碳源的利用程度来反映土壤微生物功能活性，WACD值作为微生物活性有效指标能够比较敏感地反映出土壤环境胁迫［30］。有研究表明，菌株所产生的铁载体因其具有螯合铁离子的独特性质能够广泛参与多种微生物生理代谢，在微生物体中微量铁离子有利于生长繁殖，但当铁离子的加入过量时，生长就被抑制［31］。本研究中施加的产铁载体菌株代谢物浓度分别为0.05、0.15、0.45 mg/mL，均可显著提高烟草青枯病根际土壤微生物对碳源的利用程度，且随着浓度提高WACD值表现为先增加后降低的趋势，与前人的研究相符［32］。在利用碳源类型与程度中对氨基酸的利用更显著，说明根际土壤微生物整体代谢能力加强，因此病土壤微生物受到产铁载体菌株代谢物的环境胁迫下，对碳源利用能力显著提高。通过进一步分析土壤微生物功能多样性发现，施加菌株代谢的根际土壤Shannon与Richness指数显著提高，说明土壤中微生物群落功能多样性与丰富度均提高，可见不同浓度的产铁载体菌株代谢物与烟草青枯病根际土壤微生物群落之间的相互作用十分密切［33］。

4 结论

从云南省哀牢山国家级自然保护区森林土壤中分离到一株产铁载体活性单位为78.79%的菌株1-5F1，鉴定为百岁兰曲霉，并初步鉴定铁载体化学结构类型为羧酸型。1-5F1菌株代谢物可提高罹烟草青枯病病土蔗糖酶与脲酶活力值、AWCD、微生物利用碳源的功能多样性和丰富度。