基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS分析不同足火方式对绿茶中叶绿素降解的影响

吴仕敏，江用文，滑金杰，袁海波,*，李 佳,*

（1.中国农业科学院茶叶研究所 浙江省茶叶加工工程重点实验室，浙江 杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

色泽是绿茶的第一感官因子，“三绿”是绿茶备受消费者喜爱的原因之一[1]。其中，“茶汤绿”的呈色物质主要是水溶性色素，“外形绿、叶底绿”的主要呈色物质是脂溶性色素[2]。叶绿素是重要的呈色物质。在茶叶加工过程中，叶绿素在叶绿素酶介导或非酶介导的热反应等条件触发下，可发生一系列转化（如异构化、脱镁化、脱植基化等），降解衍生出化学性质、色泽各异的产物。目前，茶叶中已有41种叶绿素被发现[3]。其中，已有约20种叶绿素分解物的结构被阐明[4]。绿茶干茶色泽主要是茶叶中叶绿素及其降解产物和茶多酚氧化产物的综合作用结果，叶绿素含量越多，色泽越绿[1]。

茶叶加工工艺技术是影响绿茶色泽的重要因素之一[1]。干燥是形成绿茶“清汤绿叶”的关键工序之一[5]，包括干燥时间、干燥温度、干燥方式等因素。其中，干燥方式对叶绿素降解的影响程度较大[6-7]。干燥分毛火和足火，足火是去水足干、色香味形成的关键[8]。茶叶加工中应用较多的足火方式主要有箱式热风足火、远红外足火、微波足火、提香机足火、理条机足火、滚筒干燥足火、六角辉锅足火等[9]。目前，关于干燥方式对绿茶品质的影响，主要集中于对汤色、香气、滋味等品质的研究，而对绿茶色泽及其叶绿素降解的影响则鲜有研究报道。

现有文献报道茶叶中叶绿素的测定方法主要有分光光度法[10-11]、薄层色谱法[12-13]以及液相色谱法[14-16]。分光光度法只能粗略测定各叶绿素组分且灵敏度低[17]。薄层色谱法耗时久且组分间分离效果不佳[18]。液相色谱法检测耗时久且前处理复杂[15]。上述方法对叶绿素及其降解组分的检测覆盖度均有待提高，难以实现对叶绿素降解通路上多个衍生产物的同时测定，且难以分离化学结构、性质接近的差向异构体。上述局限性难以满足对茶叶中叶绿素素组分详细表征及对其转变过程系统研究的需求。超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole orbitrap high resolution-mass spectrometry，UPLC-QExactive Orbitrap-MS）联用技术通过提取一级质谱的精确质量数进行定性和定量，同时采集二级质谱进一步提高定性的准确性，实现对目标物的快速定性和定量[19]。目前，该技术在茶学中已应用于代谢组学分析，用于复杂组分的分离分析[20-22]。

为此，本研究建立基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的绿茶中叶绿素及其降解组分分析方法，并系统比较远红外足火、微波足火、提香机足火、理条足火以及六角辉锅足火5种不同足火方式对绿茶色泽品质和叶绿素降解途径的影响，为绿茶加工提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

一芽二叶的“翠峰”品种春季鲜叶，采摘于浙江省开化县。

二氯甲烷（CH2Cl2）、甲醇、乙腈、异丙醇（均为色谱纯） 德国默克公司；醋酸铵、甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）（均为色谱纯）美国Sigma-Aldrich公司。

标准品叶绿素a、叶绿素b 美国Sigma-Aldrich公司；脱镁叶绿素a（纯度97%） Wako和光纯药工业株式会社（日本）；脱镁叶绿酸a（纯度＞90%）、焦脱镁叶绿酸a（纯度＞98%） 美国Cayman Chemical公司；脱植基叶绿素a（分析标准品级） 美国ChromaDex公司。

1.2 仪器与设备

80型电磁杀青机、定制型远红外提香机 姚江源茶叶茶机有限公司；6CW-6E型微波杀青机 江苏农业机械化研究所；6CR-55型茶叶揉捻机、6CTH-6型茶叶箱式提香机、6CLZ60-8型振动理条机、6CLH-60型六角辉干机 浙江上洋机械有限公司；6CJK-40型茶叶解块机浙江绿峰机械有限公司；CM-600 d型便携式分光测色仪柯尼卡美能达（中国）投资有限公司；Ultimate 3000超高效液相色谱仪 美国Dionex公司；Q-Exactive型高分辨质谱 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 制茶流程

自然摊放（室内温度25～28 ℃、相对湿度70%～80%）待含水率降至70%左右，进行滚筒杀青（投叶量150 kg/h、260 ℃、75 s）含水率降至47%左右，摊凉1 h后，轻揉30 min（投叶量30 kg、转速50～52 r/min），烘毛火（110 ℃、20 min）。随后将茶叶随机等量分成5 份，分别用远红外足火（115 ℃，3 min）、微波足火（110 ℃，5 min）、提香机足火（80 ℃，40 min）、理条机足火（170 ℃，20 min）和六角辉锅足火（120 ℃，40 min）进行足火干燥，使含水率降至6%左右。

1.3.2 感官审评

参照GB/T 23776ü2018《茶叶感官审评方法》，由具有多年评茶经验的专家对5种足火方式的茶样进行感官审评。称取50 g茶样，把盘，对外形进行审评，后称3 g茶样，加入150 mL沸水冲泡4 min后，对汤色、滋味、香气、叶底进行审评，并按照加权法进行评分（总分＝外形×25%+汤色×10%+香气×25%+滋味×30%+叶底×10%）。重点审评外形色泽、茶汤汤色以及叶底色泽。

1.3.3 色差分析

使用便携式色差仪对茶样的外形色泽进行3次重复测定，获得不同足火方式下茶样的色差参数，计算各色差参数平均值。采用CIEL*a*b*体系进行检测。其中L*值代表明亮度；a*代表红绿色度，+代表红色程度，-代表绿色程度；b*代表黄蓝色度，+代表黄色程度，-代表蓝色程度。

1.3.4 叶绿素组分的液相色谱-质谱分析

液相色谱-质谱分析参考Li Jia等[23]的方法。

茶样预处理：茶叶粉碎过筛后称取（20.0f0.1）mg，先后加入300 µL含内标的甲醇溶液（内标化合物2.00 µg/mL溶血磷脂酰胆碱（19∶0）和1.33 µg/mL磷脂酰胆碱（19∶0/19∶0））、1 mL MTBE进行提取，再加入300 µL超纯水使两相分层，高速离心取上清液，稀释后待分析。每个茶样均进行3次重复实验。

液相色谱-质谱测定：采用超高效液相色谱联用电喷雾电离-四极杆-静电场轨道阱质谱进行分析。T3色谱柱（2.1 mmh100 mm，1.8 µm）；流动相A为乙腈-水（6∶4，V/V），流动相B为异丙醇-乙腈（9∶1，V/V）均含有10 mmol/L的醋酸铵。流速为0.26 mL/min。梯度洗脱：68% A、32% B，平衡2 min；2.0～4.0 min内，线性降至40% A，线性递增至60% B；4.0～13.0 min，线性变至3% A，97% B，并保持4 min；随后，在0.1 min内降至32% B、68% A，平衡2.9 min；进行下一次进样。总运行时间为20 min。在电喷雾离子源正模式采集高分辨全扫描质谱数据，质量扫描范围m/z200～1 200。喷雾电压、毛细管温度和气体加热器温度分别为3.2 kV、320 ℃和450 ℃。鞘气和辅气分别为40 arb和10 arb。质谱采用25、35 eV和45 eV的阶跃碰撞能。

1.4 数据处理

采用Xcalibur软件（版本2.2，Thermo Fisher，美国）对目标化合物进行高分辨提取离子流色谱分析，获得其峰强度；与内标化合物溶血磷脂酰胆碱（19∶0）和磷脂酰胆碱（19∶0/19∶0）进行归一化校正后，获得其相对定量结果。采用SIMCA-P 14.1软件（Umetrics，瑞典）进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）。采用SPSS 19.1软件（IBM，美国）进行单因素方差分析（One Way-ANOVA，LSD多重检验），P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 茶叶中叶绿素组分及其降解产物的色谱分析

建立一种基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的茶叶中叶绿素组分及其主要异构化和降解衍生物的分析方法，共计19个化合物（表1）。其化学结构见图1。上述化合物的鉴定主要基于精确质量数、MS/MS特征，反相色谱柱保留规律和标准品的验证。在20 min的色谱分离梯度内，19个化合物于保留时间1.2～11.8 min内流出，并得到较好分离。其中，极性较强的脱植醇有关降解衍生产物（脱镁叶绿酸、脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿酸等）洗脱较早，在1.2～3.3 min内出峰；而非极性较强的脂溶性色素（叶绿素、脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素、羟基脱镁叶绿素等）则洗脱较晚，主要集中于8.7～11.8 min内出峰。现有研究中，叶绿素组分测定的方法常用分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法等。李名君等[17]利用分光光度法检测8种叶绿素组分，但涉及酸处理、皂化处理等复杂前处理。Lucie等[24]利用高效液相色谱法和高效薄层色谱法2种分离技术对大麦草中Chl a和Chl b进行分析，但无法对其他降解组分进行分析。Lee等[25]利用高效液相色谱法在茶叶检测出Chl a、Chl b、Phe a、Phe b共4个组分，分析耗时25 min。Yu Xinlei等[26]利用高效液相色谱法在茶叶中检测出Chl a、Chl b、Cd a、Cd b、PyrPhe a、PyrPhe b、Po b共计7个组分，分析耗时40 min。相比上述方法，本实验建立基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的叶绿素及其降解产物分析方法，预处理简单，耗时更短，在20 min内可同时检测叶绿素降解通路上的19个组分，检测覆盖度更高，且可较好地分离检测6 对叶绿素组分的差向异构体。

表1 叶绿素及其降解产物组分的结构、分子式、保留时间、离子化模式和质荷比Table 1 Molecular formulae, retention times, ionization modes and mass-to-charge ratios of chlorophyll and chlorophyll derivatives

图1 叶绿素结构Fig.1 Structures of chlorophylls

2.2 足火方式对绿茶色泽品质的影响

如表2所示，不同足火方式所制得绿茶在外形、汤色、叶底色泽上均有差异。其中，外形色泽品质差异比较明显，微波足火最优（93 分），黄绿尚润；其次为理条足火、六角辉锅足火（92.5 分），呈黄绿色；提香机足火（91.5 分）、远红外足火则较劣（90 分），色泽稍暗。汤色品质：5种足火方式从高到低依次为六角辉锅足火、微波足火、理条足火、提香机足火和远红外足火。叶底色泽品质：以微波足火、六角辉锅足火、理条足火为最佳（均为92.5 分），提香机足火稍次之（92 分），远红外足火绿茶最差（91.5 分）。综合外形、汤色、叶底色泽发现，不同足火方式下绿茶色泽品质的优劣如下：微波足火＞理条足火、六角辉锅足火＞提香机足火＞远红外足火。

表2 足火方式对绿茶感官品质的影响Table 2 Effects of different full drying methods on the sensory quality of green tea

如表3所示，不同足火方式制得绿茶外形色泽属性（L*、a*、b*）均存在显著差异。亮度L*值以微波足火最高，理条足火最低。绿度（-a*）值亦是微波足火方式表现最优，高于其他4种足火方式。远红外足火的绿度（-a*）和黄度（b*）均为最差。综合绿茶干茶亮度（L*）、绿度（-a*）、黄度（b*）可知，微波足火制得的绿茶外形色泽属性最佳，与感官审评结果一致。

表3 足火方式对绿茶色泽属性的影响Table 3 Effects of different full drying methods on the color of green tea

已有研究发现，理条足火和六角辉锅足火均是通过热传导方式，反复摩擦滚炒使茶叶色泽发黄发灰[27]。提香机足火采用热对流方式，干燥时间久，温度不均匀，对成分破坏大[8]。远红外足火、微波足火的热传递方式均是热辐射。其中，远红外足火使茶叶内外均匀受热，导致迅速失水，容易使茶叶色泽发褐[28]。微波足火通过高频微波振荡诱导茶叶内部分子高速碰撞产生摩擦热量[29]，引起水分子的热运动共振，主要对水分作用，对茶叶的其他成分影响较小[30]。然而，上述不同足火方式对色泽影响的化学物质基础（即对叶绿素降解的影响），还需进一步解析。

2.3 足火方式对叶绿素降解的影响

2.3.1 绿茶加工过程中叶绿素降解途径

叶绿素极不稳定，易受温度、pH值、光照、酶等因素的影响[31]，形成一系列的降解产物。在绿茶的加工过程中，叶绿素的降解途径如图2所示。1）异构化：由于C-132的不对称性，在温和的加工条件下，Chl a和Chl b就可以转化为各自的同分异构体Chl a’和Chl b’[32]。2）酶促反应：在叶绿素酶的作用下发生水解反应，脱去C17的植醇，生成水溶性脱植基叶绿素，仍为绿色[33]。3）脱镁降解反应：酸性条件促进了卟啉环上Mg2+的流失，将叶绿素转化为脱镁叶绿素，呈黄褐色[34]。脱植基叶绿素在同等条件也易发生脱镁反应，降解成脱镁叶绿酸。4）脱羧甲基化反应：在长时间热处理作用下，C-132失去羧甲氧基，生成焦脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿酸，颜色较脱镁叶绿素暗[35]。蓝绿色和黄绿色的Chl a和Chl b经过不同降解途径产生不同色泽的叶绿素降解产物[10]。因此，控制或减少加工过程叶绿素的降解是保持绿茶色泽品质的方式之一。本研究建立的叶绿素及其降解衍生产物的分析方法，可实现对上述通路（图2）中酶降解、非酶降解有关产物的全面分析，有利于系统解析茶叶加工中叶绿素的代谢通路及在不同加工工艺下的变化。

图2 加工过程中叶绿素降解途径Fig.2 Chlorophyll degradation pathways during green tea processing

2.3.2 不同足火方式绿茶中叶绿素及其降解产物组分的OPLS-DA

为了快速分析不同足火方式所制绿茶间叶绿素及其降解组分含量的差异，首先以不同叶绿素及其降解组分的含量为X变量，5种不同足火方式为Y变量，进行OPLSDA。如图3所示，不同足火方式所得茶样得到明显分离（R2X=0.998，R2Y=0.902，Q2=0.715）（图3A）。对模型Y变量进行交叉验证（20次的置换检验）（图3B），截距分别为R2=（0.0，0.335），Q2=（0.0，-1.48），表明模型未过拟合。上述5种方式在得分图上的相对距离与其感官色泽品质的差异大小一致。为进一步探索不同组分含量与不同足火方式之间的关系，对OPLS-DA进行载荷分析。从图3C可以看出，微波足火所影响较大的组分为Chl a、Chl b、Phe a、Phe b等，而远红外足火所影响较大的组分为Phe b、PyrPhe a、PyrPhe b等。

图3 OPLS-DA得分图（A）、置换检验图（B）和因子载荷图（C）Fig.3 Score scatter plot of OPLS-DA model (A), cross-validation of the OPLS-DA model by 20 permutations (B), loading plot of OPLS-DA model (C)

2.3.3 足火方式对绿茶中叶绿素及其降解产物组分变化的影响

为探究不同足火方式所制绿茶之间叶绿素及其降解组分的差异，对各组分含量进行单因素方差分析（ANOVA，LSD多重检验）（表4）。发现不同足火方式所制得绿茶中Chl a、Chl b、Chl a’、Chl b’、Phe a、Phe a’、Phe b、PyrPhe a、PyrPhe b、HydPhe a、HydPhe a’、PyrPo a、PyrPo b含量均存在显著差异（P＜0.05）。其中，除PyrPo a、PyrPo b为水溶性外，其他均为脂溶性。足火方式主要影响脂溶性叶绿素降解产物的生成，这些产物是决定绿茶色泽品质的关键因素[36]。微波足火制得绿茶中Chl a、Chl b、Chl b’、Phe a、Phe b、Phe a’含量较高，分别为12.813 9f0.75、13.586 0f0.473 1、2.698 1f0.090 8、302.901 0f32.853 8、16.229 4f1.899 2、54.706 6f3.557 7；相应组分含量是远红外足火的2.4、1.55、1.38、1.3、1.1、1.3 倍。Chl a、Chl b与L*值呈正相关，与a*呈负相关，其含量越高，绿色色泽越强[37]，该结果与色泽属性分析结果一致。远红外足火所制得绿茶中PyrPo a、PyrPo b、PyrPhe a、PyrPhe b组分含量最高，分别为0.105 6f0.004 8、0.004 1f0.000 2、63.801 1f2.604 4、4.341 7f0.222 1，分别是微波足火的4.4、10.3、3.8、4.3 倍，PyrPo a、Pyrpo b、PyrPhe a、PyrPhe b均来自脱羧甲基化反应途径，均呈现比Po a、Po b、Phe a、Phe b还深的褐色[38]。所以，远红外足火加工绿茶所发生脱羧甲基化反应的程度最大。而提香机足火、理条足火、六角辉锅足火的叶绿素及其降解组分含量均介于微波足火和远红外足火之间。所以，基于成分，可推测微波足火所制绿茶干茶色泽最佳，远红外足火最次，与感官审评结果一致。

表4 足火方式对绿茶叶绿素及其降解组分的影响Table 4 Effects of different full drying methods on chlorophyll degradation of green tea

由叶绿素降解途径可知（图2），Chl/（Phe+PyrPhe+HydPhe）可反映热降解途径中叶绿素整体发生降解的程度[23]，由图4可知，该比值在微波足火所制绿茶中最高，在远红外足火中最低。PyrPhe/Phe、PyrPo a/Po a、PyrPo b/Po b可反映脱羧甲基化反应的程度，3个比值均为远红外足火处理下最高，微波足火下最低，前者分别为后者的4.9、5.3、12.5 倍。Phe a/Chl a、Phe b/Chl b可以反映Chl a、Chl b发生脱镁降解反应的程度，2个比值均为远红外足火处理最高，微波足火最低，Phe b/Chl b值稍高于提香机足火。Chl a’/Chl a、Chl b’/Chl b可以反映异构化反应的程度，微波足火所制绿茶Chl a’/Chl a、Chl b’/Chl b是5种足火方式中最低的。因此，上述结果均表明微波足火处理下发生脱镁降解反应、异构化、脱羧甲基化等降解反应程度均最低，可较好地保护绿茶色泽。

图4 不同足火方式制得绿茶中叶绿素及其降解组分间的比值Fig.4 Ratios between chlorophylls and their degradation products in green tea prepared by different full drying methods

3 结 论

建立一种基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的茶叶中叶绿素及其降解衍生组分的分析方法，该方法预处理简单，耗时更短，检测覆盖度更高，且可较好地分离检测叶绿素组分的差向异构体。基于该方法，结合感官分析和色差分析，系统研究不同足火方式对绿茶色泽和叶绿素降解的影响。结果表明，微波足火所制得绿茶色泽品质最佳，远红外足火最次。微波足火所制得绿茶中Chl a、Chl b、Chl b’、Phe a、Phe a’、Phe b含量显著高于远红外足火，而降解产物PyrPo a、Pyrpo b、PyrPhe a、PyrPhe b含量显著低于远红外足火。微波足火所制得绿茶Chl/（Phe+PyrPhe+HydPhe）比值最高，PyrPhe/Phe、Phe a/Chl a、Chl a’/Chl a、Chl b’/Chl b、PyrPo a/Po a、PyrPo b/Po b比值均是5种足火方式中最低的，而Phe b/Chl b较低。故微波足火下叶绿素降解较少，更有利于绿茶色泽的保护。本研究可为绿茶品质提升和定向化加工提供理论基础和技术指导，建立的叶绿素及降解产物组分的分析方法亦可拓展应用于其他食品、植物领域。由于不同茶叶品种对微波加工工艺的适应性和工艺条件有待优化以及微波干燥设备有待改进，将微波足火应用到茶叶实际生产中还需进一步研究。