鲢鱼酶解产物对冷冻面团品质特性的影响

刘 伟，符禹婷，俞 健，王发祥，李向红，刘永乐*

（长沙理工大学化学与食品工程学院，湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心，湖南 长沙 410114）

冷冻面团技术是指在面制品的生产过程中，运用冷冻技术对半成品进行冷冻处理，将面团制作和熟制流程独立成两个环节的面点新工艺[1]。相对传统的面点加工和销售方式，冷冻面团相关产品具有成本低、保质期长、便于运输和冷藏、利于连锁企业标准化的特点[2]，在中央厨房模式和连锁经营概念的日益普及的背景下，是我国传统发酵面制品工业化的必然趋势。然而，冷冻处理会降低冷冻面团品质，影响熟制后面制品的质量，如酵母活性降低、发酵时间延长、持气能力减弱、面团强度受损、面包体积减小等[3-5]。关于冷冻损害面团品质的机理，目前普遍认为冰晶的形成导致面团中酵母菌活性降低、面筋网络结构破坏、水分状态改变等[5]。目前，添加合适的抗冻保护剂仍是改善面团冷冻损害的最有效途径，其中应用和研究最多的保护剂主要有复合磷酸盐、海藻糖、蔗糖酯、黄原胶、抗冻蛋白（肽）等[5-6]。

鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）是我国四大家鱼之一，2018年全国养殖量达385.89万 t，是我国第二大淡水养殖鱼类[7]。但鲢鱼肉质发面、肌间刺多、土腥味重，不仅食用品质差，而且价格低廉，是最典型的大宗低值淡水鱼，目前仍缺乏具有竞争力的深加工途径[8]。近年来，研究者关注到鲢鱼肌肉[8-9]、肌肉蛋白[10]或加工副产物[11]的酶解产物具有优良的抗冻活性，在冷冻鱼糜[10-11]、酵母菌细胞[8-9]等的抗冻保护中应用潜力巨大。课题组前期研究发现，在酵母菌悬浮液中添加4 g/100 mL的优选鲢鱼酶解产物能将冻融处理后酵母菌存活率由0.71%提高至90%以上[12]，将该酶解产物作为抗冻剂添加至冷冻面团中，能大幅提高冷冻面团（6次冻融循环）的酵母菌存活率和发酵力保存率，缓解醒发时间延长的问题，并能提高面包的比容和感官品质[13]。然而，肌肉或蛋白酶解产物的组成复杂，通常存在还原性肽（抗氧化性）[14-15]，而面团中加入还原性物质对面筋结构的影响一般均为负面[16]，目前还没有研究鲢鱼酶解产物对面团质构特性、面筋形成等特性影响的报道。本研究将以复合蛋白酶酶解鲢鱼肌肉不同时间制备的酶解产物添加至冷冻面团中，分析其对冷冻面团焙烤、流变特性及面筋结构等的影响，旨在为以鲢鱼酶解产物作为冷冻面团品质改良剂及其定向调控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鲢鱼购自湖南长沙当地菜市场，每尾质量为（2.5f0.5）kg；白砂糖、食盐 长沙市购；高筋面粉克明面业股份有限公司；活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；复合蛋白酶（≥1.5 AU/g） 诺维信（中国）生物技术有限公司；D-(+)-海藻糖二水合物（纯度≥98%） 上海笛柏化学品技术有限公司；葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）（100 U/mg）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯或生化试剂。

1.2 仪器与设备

BIOTECH-5L生物酶反应器 上海保兴生物设备工程有限公司；HMJ-A35M1型和面机 小熊电器股份有限公司；JCD-5型电动压面机 浙江天喜网络科技有限公司；YXD-Z204商用箱式电烤炉 广州市三鼎金属制品有限公司；TA.XT.Plus型物性测定仪 英国Stable Micro System公司；粉质仪 北京东方孚德技术发展中心；HWS-250B恒温恒湿箱 天津市泰思特仪器有限公司；TESCAN MIRA3场发射扫描电镜 捷克TESCAN有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鲢鱼酶解产物的制备

参考熊思佳等[12]的方法。新鲜鲢鱼宰杀取肉，用组织捣碎机搅碎，按固液比1∶5（g/mL）与水混匀后加入酶反应器，加入相当于鱼肉（水分质量分数按80%计）干质量3%的复合蛋白酶，在50 ℃、pH 6.5f0.05条件下分别水解15、30、60、120、240 min，90 ℃灭酶15 min，于4 000hg离心15 min后，收集上清液进行冷冻干燥，获得酶解时间为15、30、60、120、240 min的鲢鱼酶解产物（蛋白质质量分数均为85%左右，水分和灰分等含量差异不大，水解度分别9.68%、13.57%、18.42%、23.27%、29.10%[12]），分别命名为SCMH-15、SCMH-30、SCMH-60、SCMH-120、SCMH-240。

1.3.2 冷冻面团的制备

空白组面团配方：面粉100%、去离子水50%、白砂糖5%、食盐1%、干酵母0.4%；阳性对照组和实验组面团分别以同样质量的海藻糖溶液（40 g/L）和鲢鱼酶解产物溶液（40 g/L）替代去离子水，相当于抗冻剂的焙烤百分比约为2%。

按配方称取面粉、白砂糖、食盐、干酵母，混合均匀置于和面机中，加入水或抗冻剂溶液，自动和面10 min，面团分成若干个30 g的小面团，放入面包模具中压平，封口膜封口，分别进行0次和4次冻融循环（-18 ℃冷冻18 h，4 ℃解冻6 h为1次冻融循环）后测定相关指标。

1.3.3 醒发时间的测定

面团按1.3.2节的方法冻融处理0次或4次循环，置于恒温恒湿箱（温度30 ℃、相对湿度85%）中并开始计时，待面团发酵至最高点触碰到封口膜时记为发酵终点，所需时间即为面团醒发时间。

1.3.4 面包比容测定

面团按1.3.2节的方法冻融处理0次或4次循环，置于醒发箱中醒发3 h。将烤箱设定为180 ℃，上下火，预热5 min，将醒发好的面团放入烤箱中焙烤15 min，焙烤结束后将面包从模具中倒出，室温冷却30 min。参照GB/T 20981ü2007《面包》，采用菜籽填充剂法测定面包比容。

1.3.5 面团拉伸强度测定

采用质构仪的抗拉测试探头A/SPR测定。用一个手工面条机将面团制成粗细均匀（直径约2 mm）的圆柱形面条，固定在探头夹具上。测试前、中、后速率分别设置为1、3、10 mm/s，距离为90 mm，触发力5 g。

1.3.6 面团黏附性和延展性测定

面团黏附性：采用质构仪和P/0.5探头测定，将面团用压面机压成厚度为4 mm的面片，铺在白瓷板上，设置测试前、中、后速率分别为1、0.5、10 mm/s，作用力1 N，返回距离10 mm，接触时间5 s，触发力0.049 N，测得曲线的最高点对应的力为面团最大黏附力，能量即曲线所围成的总面积代表面团黏附性[17]。

面团延展性：采用质构仪的破裂测试装置HDP/TPB和P/1s探头测试，将4 mm的面片固定在HDP/TPB夹具上，测试前、中、后速率分别设置为1、1、10 mm/s，距离70 mm，触发力0.049 N，通过探头与面片接触后向下移动，以探头从接触面片到面片破裂所运行的距离表示样品的延展性，最大力表示样品的韧性[18]。

1.3.7 粉质特性测定

空白组、海藻糖组和SCMH-30组小麦粉分别按1.3.2节加入配方中除水以外的物质混匀，葡萄糖氧化酶组（SCMH-30+GOD）在SCMH-30组的基础上加入20 mg/kg（以面粉质量计算）GOD；参照GB/T 14614ü2006《小麦粉 面团的物理特性 吸水量和流变学特性的测定 粉质仪法》测定面粉的粉质特性。

1.3.8 扫描电镜观察面团显微结构

参考Xin Chen等[19]的方法稍作修改。将新鲜面团和冻融4次的面团置于-70 ℃超低温冰箱冷冻12 h，真空冷冻干燥，制得样品。将冻干的样品用手从中间掰开，避免面筋结构的机械损伤，喷金后用扫描电子显微镜观察其微观结构。

1.4 数据统计与分析

每组实验进行3个平行，以 fs表示，结果以Origin 2018软件绘图；样本均数以SPSS 25.0软件进行方差分析，先进行Welch检验（α=0.05），方差齐者用Duncan法进行多重比较，方差不齐者用Dunnet-T3分析，结果以小写字母在图表中标注，不同字母表示不同处理样本在相同冻融循环次数时差异显著（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 鲢鱼酶解产物对冷冻面团发酵和焙烤特性的影响

如表1所示，冻融处理前，各组面团的醒发时间在61～67 min之间，面团焙烤后面包比容在2.24～2.38 mL/g之间，均无显著差异（P＞0.05）。冻融循环处理4次后，各组面团醒发时间均显著增加，面包比容均显著降低，可能是因为冻融过程中冰晶的形成和重结晶导致面团中酵母菌、面筋结构的损伤导致其产气和持气能力下降所致[20]。空白组面团经4次冻融循环后，醒发时间延长至170 min（增幅为159%），面包比容仅为1.54 mL/g（降幅达34%），而海藻糖组和SCMH-15、SCMH-30、SCMH-60组面团冻融前后醒发时间和面包比容的变化幅度均小于空白组，表明其添加有利于减轻面团的冷冻损害，保持酵母菌活力，抑制面包比容下降；其中，海藻糖组和SCMH-30组醒发时间的延长幅度分别为106%和92%，面包比容减小幅度分别为25%和26%，说明其对面团的抗冻保护效果相对最好。海藻糖有较高的玻璃化转变温度，能通过结合水分子减少冰晶生成，已被证实是一种优良的抗冻保护剂[21-22]；课题组前期研究表明，不同鲢鱼酶解产物的氨基酸组成和含量差别不大，但随着水解度增加，其分子质量分布明显变化、小分子组分含量逐渐增加[23]；其中SCMH-30组60%以上的肽分子质量在1 000～2 000 Da之间[8]，对酵母菌的抗冻保护效果最佳[12]，其能吸附体系中的自由水而限制水分子流动，增加不冻结水含量、抑制冰晶的形成，从而显著提高了酵母菌冻融过程中的存活率[9]。因此，鲢鱼酶解产物也是一种潜在的冷冻面团抗冻剂。

表1 鲢鱼酶解产物对冷冻面团醒发时间和面包比容的影响Table 1 Effects of SCMHs on proofing time of frozen dough and bread specific volume

2.2 鲢鱼酶解产物对冷冻面团拉伸强度的影响

如图1所示，冻融前，空白组与海藻糖组面团的拉伸强度差异不大，但所有添加酶解产物的面团的拉伸强度均有所降低，说明添加鲢鱼酶解产物一定程度上削弱了面团的拉伸强度，可能是因为酶解产物中的还原性肽影响了面筋蛋白的聚合和二硫键的结构状态，从而降低了面团筋力[24-25]；李向红等[15]报道水解度10%左右的鲢鱼酶解产物抗氧化活性最高，本研究SCMH-15和SCMH-30的水解度分别为9.68%和13.57%，而SCMH-15和SCMH-30组面团的拉伸强度显著低于其他组（P＜0.05），进一步证实了鲢鱼酶解产物中的还原性肽损害了面筋强度的推测。4次冻融循环后，所有处理组面团的拉伸强度均有所降低，说明其面筋网络结构在冻融过程中受到了破坏[26]；其中空白组降幅超过18%，海藻糖、SCMH-15、SCMH-30组的降幅分别为2%、4%和1%，远小于空白组，这与其具有较好的抗冻保护活性一致。

图1 鲢鱼酶解产物对冷冻面团拉伸强度的影响Fig.1 Effects of SCMHs on the tensile strength of frozen dough

2.3 鲢鱼酶解产物对冷冻面团黏附性的影响

研究过程中发现在相同条件下和面，加入部分鲢鱼酶解产物的面团黏度较大，采用质构仪测定相应面片的黏附性，结果如图2所示。冻融前空白组和海藻糖组面团的黏附性分别为98、97 mNgs，最大黏附力分别为1 408、1 326 mN，无显著差异（P＞0.05）；但添加了酶解产物后面团黏附性均有一定程度增加，这与和面时观察到的现象一致，其中SCMH-15和SCMH-30组面团的黏附性分别为171 mNgs和197 mNgs，最大黏附力分别为1 889 mN和1 755 mN，显著高于空白组和海藻糖组（P＜0.05），也高于其他SCMH组，可能与SCMH-15和SCMH-30的抗氧化活性最高有关[15]。4次冻融循环后，所有组面团的黏附性和最大黏附力均显著上升，与Lu Lu等[27]报道的结果类似，可能是因为冻融处理损伤了面筋网络结构和淀粉颗粒，对水分子的束缚性减弱以致水分迁移释放，从而使面团黏性变大[26,28]。

2.4 鲢鱼酶解产物对冷冻面团延展性的影响

面团的延展性是基于质构仪的穿透模式测试，图3为穿破测试的力-延展曲线图。冻融前海藻糖组和空白组的曲线高度相似，但全部酶解产物组曲线的力明显减小，延展距离稍有增加，说明添加酶解产物使面团的韧性（抗延展阻力）减小，影响了面团的延展性，这可能与酶解产物的还原性影响了面筋的筋力有关；其中，SCMH-15和SCMH-30组的力最小，而且力-延展曲线不典型（与空白组相比），主要是因为其面团黏附性大，导致抗延展阻力小且测试过程中穿破非瞬时发生[29]。经过4次冻融循环后，所有面团的延展距离均有所增加，可能与冻融后面团筋力受损有关；其中空白组面团的延展距离增加了约13%，而海藻糖、SCMH-15、SCMH-30组的延展距离分别增加了7%、2%和5%，表明其样品延展性受冻融循环处理的影响相对较小，这也与其抗冻保护效果的结果基本一致。

2.5 鲢鱼酶解产物对冷冻面团结构的影响

综合上述结果，鲢鱼酶解产物中SCMH-30对冷冻面团的抗冻保护效果最好，而对面团黏附性和拉伸强度等影响也相对较大，故选择SCMH-30组面团观察其显微结构在冻融处理前后的差异，结果如图4所示。冻融前，空白组面团结构均匀，淀粉颗粒密集的深埋在面筋网络结构中[30]；海藻糖组面团结构与空白组相似，但SCMH-30组面团中淀粉颗粒被面筋包埋的程度明显较浅，可能是因为SCMH-30中的还原性物质影响了面筋网络的形成，导致面筋形成较少或部分二硫键被破坏，这也是其黏弹和拉伸强度相对较差的主要原因。4次冻融循环后，空白组面团出现了大的孔隙（圆圈所示），许多淀粉颗粒从面筋蛋白中脱离，表明冻融过程中面筋网络受到了破坏[31]；而且部分淀粉颗粒发生变形（箭头所示），可能与冻融过程中形成的大冰晶挤压有关[32]。与空白组相比，海藻糖组面团中也观察到部分淀粉颗粒变形，但淀粉颗粒基本上均镶嵌在面筋网络中；而SCMH-30组面团结构与海藻糖组相似，但淀粉颗粒未观察到明显变形，进一步证实了其对冷冻面团的良好抗冻保护效果。

图4 鲢鱼酶解产物对冷冻面团面筋显微结构的影响Fig.4 Effects of SCMHs on the gluten microstructure of frozen dough

2.6 鲢鱼酶解产物对冷冻面团粉质特性的影响

粉质特性反映面粉通过加水在形成面团过程中的流变学特性，对最终面团的品质具有重要的影响[33]。由表2可见，空白组和海藻糖组面粉的吸水率、面团形成和稳定时间、弱化度、粉质指数均无显著差异，表明添加海藻糖对面粉的粉质特性影响不大；然而，SCMH-30组面粉的吸水率相对空白组降低不显著（P＞0.05），但面团形成时间、稳定时间、粉质指数均显著降低，弱化度则显著上升（P＜0.05），说明SCMH-30的添加明显改变了面粉的粉质特性，使面团的筋力和弹性下降，影响其加工性能。

表2 鲢鱼酶解产物对面粉粉质特性的影响Table 2 Effects of SCMHs on the farinographical properties of wheat flour

此外，相对SCMH-30组，SCMH-30+GOD组面粉的吸水率、粉质指数显著增加，弱化度则显著降低（P＜0.05），面团的形成时间和稳定时间也有所增加，说明GOD的添加能明显改善鲢鱼酶解产物对面粉粉质特性的不利影响。GOD是一种常见的面团改良剂[34]，能产生H2O2将面团中的自由巯基氧化成二硫键，促进面筋网络结构形成，从而改善面粉的粉质特性[35]。这也证实了鲢鱼酶解产物中的还原性肽可能是改变面团的流变性质的主要因素，而通过添加氧化剂等方式可调控其负面影响。

3 结 论

鲢鱼价格低廉，每年养殖产量约400万 t，是最典型的大宗低值淡水鱼，将其酶解后加工成抗冻剂是提升其附加值的重要途经之一。课题组前期研究发现鲢鱼酶解产物具有优良的酵母菌抗冻保护活性，是一种潜在的冷冻面团品质改良剂。本研究将系列鲢鱼酶解产物作为抗冻剂分别加入冷冻面团中，面团醒发时间、面包比容测定和电镜观察结果均证明了其良好的冷冻面团抗冻保护活性，能改善4次冻融循环后面团的发酵性能和焙烤特性。然而，鲢鱼酶解产物组分复杂，其含有的某些还原性肽可能会给面团面筋结构的形成和稳定带来负面影响，从而导致面团黏附性增加、韧性和拉伸强度减小，最终影响冷冻面团及其产品的品质。粉质特性分析表明，添加酶解产物使面粉的吸水率、面团形成和稳定时间、粉质指数显著降低，弱化度显著上升，而同时加入GOD能显著改善面粉的粉质特性，进一步印证了酶解产物的还原性是损害面团流变性质的重要原因，也为后续定向调控酶解产物对冷冻面团的改良作用提供了新思路。