生物正交反应及其在药学中的研究进展

温 琪 罗嘉琰 邵浩东 邓张双 滕 鹏

(1.浙江大学 药学院 药物发现与设计研究所,杭州 310058;2.中国药科大学 药学院,南京 210009;3.华东理工大学 药学院,上海 200237;4.三峡大学 生物与制药学院,湖北 宜昌 443002)

0 引言

生物正交反应(Bioorthogonal reaction)是一类能够在生物体环境系中尤其是在活体动物内进行、且不与周围其它生物化学过程相互干扰的化学反应[1-2].由于生物体系的复杂性,具有高度专一性和快速反应能力的生物正交反应是化学生物学领域的重要前沿,为科学家们研究生命进程带来了革命性的技术方法,对生物体系的标记和功能调控有着重要应用.生物正交反应通过化学和生物反应来选择性地高效修饰报告基团在靶标上,其主要反应类型包括初期K.B.Sharpless和M.Meldal教授发现的铜催化的叠氮和末端炔基之间的1,3-偶极环加成反应(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition,Cu AAC),以及Bertozzi教授等改进的环张力型炔烃参与的无金属催化剂使用的环加成反应(strain-promoted azidealkyne cycloaddition,SPAAC).研究者们后来发现带有环张力的烯烃也可以发生类似的环加成反应,尤其当采用四嗪和反式环辛烯时,由于受环辛烯环内张力释放和生成气态副产物的双重驱动作用,该逆电子需求的狄尔斯-阿尔德(inverse-electron-demand Diels-Alder,IEDDA)反应的反应速率远大于之前的反应,并能够用于活体成像等体内生物标记反应.除反式环辛烯外,环丙烯、降冰片烯、氮杂环丁烯等具有张力的小环烯烃也可与四嗪快速反应.这些革命性的化学技术极大地促进了化学生物学这个新兴交叉领域的发展.

2000年,Bertozzi课题组开发出能够用于化学修饰细胞表面的Staudinger偶联反应,逐渐开启了生物标记领域的研究热潮.经过20年的发展,由于具有特异性位点标记的优点[2],生物正交反应已被研究人员广泛使用在复杂生物体系中标记、分离和研究蛋白[2]、糖类[3]、脂类[4-5]等不易或者不能通过基因方式修饰的生物活性分子,在活细胞成像、疾病诊断和生物组学分析中发挥了重要的作用.我国的研究者也在该领域做出了杰出的贡献[6-7],也综述介绍了生物正交反应的原理和研究现状.陈鹏等课题组在生物正交反应[8-9]、位点特异性标记蛋白[10]及其生物正交剪切反应(bioorthogonal cleavage reactions,BCRs)[11]等方面分别总结了该领域的进展,该课题组也综述报道了生物正交反应在我国的研究进展[12].围绕IEDDA剪切反应在生物正交化学领域的发展与生物学研究中的应用尤其是生物成像也有很好的综述报道[13].

近年来,生物正交反应在生物医药研究中也有广泛的应用前景.本文首先简要介绍生物正交反应的主要类型;然后总结其在药物化学中的研究进展,包括该反应在药物靶点验证和药物活性分子骨架发现等方向的研究进展;最后在此基础上对该领域在药物化学发展中的挑战和未来发展方向进行了展望.

1 金属催化的生物正交反应

1.1 铜(Cu)催化的生物正交反应

生物正交反应的最显著要求之一是反应具有较高的反应速率,而之前发现的大部分反应都难以满足这个条件.一价铜离子催化的叠氮化合物与含有末端炔烃的环加成反应Cu AAC 即“点击化学(click chemistry)”是发现最早、研究最多的生物正交反应之一.叠氮化合物与炔基之间的环加成反应最早是由Huisgen于1963年发现的,但是该环加成反应条件苛刻,且反应速率较慢,而K.B.Sharpless 和M.Meldal两位教授于2002 年发现一价铜离子能够显著加快叠氮化合物和炔基之间的环加成反应,该反应条件温和,只要在室温条件下即可进行,且反应速率大大加快,约为之前的一百万倍[14-15].

将化学反应应用到生物体中首先必须要考其虑毒性问题,而前文提到的在生物正交反应中起催化作用的一价铜离子能够参与产生对生物体系有毒的活性自由基,严重影响一价铜离子催化的反应应用.为了解决这一问题,研究者们发现,加入配体与铜离子形成配合物能够有效地降低毒性,也可增加该一价铜的稳定性并加快反应速率,这种优化方式被称作由配体辅助的Cu AAC.目前已知的配体有寡聚三氮唑类化合物TBTA[16]和水溶性较好的THPTA[17],以及其它TBTA 的水溶性类似物(如BTTAA、BTTES、BTTP和BTTPS)(如图1所示)[11,18],天然氨基酸组氨酸也可有效辅助Cu AAC反应且几乎无细胞毒性.

图1 Cu AAC中常用到的配体

除了通过配体螯合铜离子来降低生物毒性、提升反应速率之外,对Cu AAC的反应底物进行特定的修饰也能够使反应速率进一步加快.一种常用的方法是在叠氮基的邻位用吡啶来修饰(如叠氮基甲基吡啶),叠氮化合物中的吡啶能够与铜离子螯合,从而使铜离子更快地参与反应[19].Wu等发现,当吡啶上含有供电子基团时,能进一步加快反应的速率[20].

除了Cu AAC偶联反应之外,铜催化的生物正交剪切反应也被报道(如图2所示)[21].陈鹏等发展了“双取代炔丙基/铜试剂”,通过炔丙基的剪切调控,实现了非天然氨基酸定点插入的细胞膜表面受体-配体相互作用的原位调控[22].这种策略也可拓展至基于氨基或者酚羟基的ADCs,这种分子内剪切反应可以实现选择性杀伤癌细胞.

图2 铜催化的生物正交剪切反应

1.2 钯(Pb)催化的生物正交反应

钯作为有机合成中常用的高效催化剂,在生物正交反应中也拥有巨大的应用潜力.钯催化的蛋白质和小分子的偶联反应在初期并不理想,直到2009 年,Davis课题组开发了一种水溶性配体—ADHP(2-氨基-4,6-二羟基嘧啶)[23].ADHP 与醋酸钯共存时能够高效地催化带有碘苯基的蛋白质与多种苯硼酸类化合物的Suzuki-Miyaura反应.两年后,Lin课题组对ADHP进行了结构优化,发现N,N’-二甲基化的DADHP能够和醋酸钯在细菌体内实现Sonogashira偶联反应以标记蛋白质[24].

随着对钯催化生物正交反应研究的不断深入,研究者发现即使不使用配体也能用钯高效地催化生物正交反应.陈鹏课题组设计了一种无需钯催化的Sonogashira偶联反应,能够对活细胞内位点特异的蛋白质进行标记.该课题组发现用PEG 链来连接染料和反应基团时,只需要硝酸钯即可实现对大肠杆菌内蛋白质的Sonogashira偶联标记细菌,不但效率高,而且没有细胞毒性[25].曲晓刚课题组开发出了一种能够被光调控的纳米钯催化剂(如图3所示),这种催化剂中的钯被负载在由偶氮苯和β-环糊精的超分子复合物修饰的大孔二氧化硅中,在光照条件下偶氮苯的构型发生变化从而诱导β-环糊精分子的解离从而恢复钯的催化活性,实现了细胞内的Suzuki-Miyaura偶联反应[26].

图3 光调控的纳米钯催化剂介导的生物正交偶联反应

生物正交反应除了常见的偶联反应外,还有生物正交剪切反应,而钯催化的生物正交剪切反应也有着广阔的应用前景.钯介导的炔丙基/烯丙氧羰基的脱除反应是生物正交剪切反应中应用最多的反应之一(如图4所示).陈鹏课题组在2014年首次报道了该类钯催化的剪切反应,在活细胞内利用钯催化脱除了炔丙基,完成了赖氨酸的“化学脱笼”,以此实现了细胞内蛋白质的原位激活[27].该课题组还将这类方法应用于酪氨酸依赖的蛋白质功能原位调控方法[28].

图4 钯介导的生物正交剪切反应

1.3 钌(Ru)催化的生物正交反应

钌催化的生物正交反应以烯烃复分解反应为主,2008年,Davis 课题组曾报道在水相中使用钌的Hoveyda-Grubbs二代催化剂来催化含烯丙基硫取代蛋白SBL-156Sac的修饰[29].进一步的研究发现,用硒取代硫得到的烯丙基硒取代的半胱氨酸(Se-allylselenocysteine,SeaC)具有更高的反应活性(如图5所示)[30].同时,他们还发现了SeaC 在发生烯烃复分解反应之后得到的产物经过氧化处理和修饰之后能够重新得到SeaC的循环.这种特殊的循环过程可被用于表观遗传学标记,被成功地应用于组蛋白乙酰化的模拟.

图5 钌催化的烯烃复分解生物正交反应

和金属钯类似,金属钌也能在生物体内介导烯丙氧羰基的脱除反应[31],原位释放出荧光探针等(如图6所示)[32].同时金属钌也能与配体相螯合,提升反应效率,提升生物相容性.

图6 钌介导的生物正交剪切反应

1.4 其它金属催化的生物正交反应

金属铱(Ir)也能催化叠氮化合物与炔基之间的环加成反应.宋汪泽研究组研究了铱配合物催化的叠氮化合物与末端炔基反应,由于铱与炔胺有着更强的配位能力,所以这种Ir AAC反应具有与传统Cu AAC不同的区域选择性(如图7(a)所示),由于铱在空气和水相中具有较强的稳定性,且细胞毒性小,Ir AAC反应具有良好的生物相容性和潜在的临床应用价值[33].Kozhevnikov研究组发现,铱的2-吡啶-1,2,4-三氮唑络合物可以提高Ir AAC反应的反应速率[34].

金属银(Ag)也能够催化二苯并氮杂环辛炔(DBCO)为底物的张力驱动的叠氮-炔基环加成反应(SPAAC).进一步研究发现,在三氟乙酸或醋酸银催化下,DBCO 会发生重排反应生成吲哚类化合物(如图7(b)所示),如果反应体系中存在游离的氨基,则会发生偶联反应.将不同功能基团先修饰到DBCO上,然后再利用这一反应即可在多肽、蛋白质等生物大分子上实现功能基团与游离氨基的偶联.这一与Cu AAC不同的发现为生物正交偶联反应提供了新的设计方法[35].

金属铑(Rh)催化生物正交反应最早在2004 年被报道,Francis课题组发现在含有盐酸羟胺的水相溶液中醋酸铑可以催化重氮化合物生成铑卡宾中间体,这种高活性的卡宾能够在酸性和室温条件下对蛋白质侧链中的的色氨酸残基实现特异性的偶联标记反应,但是这种强酸性(p H＜3.5)条件限制了该反应的应用[36].该同一课题组优化了反应条件,发现在四丁基羟胺的存在下Rh AAC 能在pH 6～7的温和条件下进行(如图7(c)所示)[37].Rh 金属肽催化的Rh AAC也可在细胞裂解液中对蛋白质底物定点修饰[38],为其在生物体中的应用奠定了基础.

图7 其它金属介导的生物正交剪切反应

2 无需金属催化的生物正交反应

2.1 环张力诱导的环加成反应(strain promoted cycloaddition reaction)

金属催化的叠氮和末端炔基之间的环加成反应是使用最为广泛的生物正交反应,由于金属离子会产生细胞毒性,研究者们通过对炔基底物进行结构改变开发出了不需要铜离子催化的叠氮-炔基[3+2]环加成反应(strain promoted azide-alkyne cycloaddition,SPAAC).早在2004年,Bertozzi课题组使用八元环炔基作为底物与修饰在细胞表面的叠氮基团进行SPAAC反应,没有发现明显的细胞毒性,但是其与叠氮化合物反应的速率较低[39].为了提高该反应效率,Bertozzi,Boons等研究者们在八元环上进行结构优化(如图8所示)[40-42],发现了更多反应速率快的环辛炔的衍生物[43-44],其中最快的二级反应速率达到了4.0 M-1·s-1.最近,Franzini课题组系统综述了包括SPAAC在内的无需金属催化的生物正交反应的机理和取代基的反应,预期对该领域将起到很好的总结和启发作用[45].

图8 已报道的主要八元环炔衍射物

硝酮也可以替换叠氮作为一种活性基团参与叠氮-硝酮环加成反应(strain-promoted alkyne-nitrone cycloaddition,SPANC),其反应速率比相同条件下的SPAAC反应要快30多倍[46].Pezacki课题组发现环状硝酮与八元环炔的SPAAC的反应更快,并成功地实现对细胞表面蛋白质的特异性染料标记[47].

2.2 逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应(IEDDA)

传统有机化学中,狄尔斯-阿尔德(DA)反应是指发生在富电子双烯体和缺电子亲双烯体之间的[4+2]环加成反应.与之相反,发生在缺电子双烯体和富电子亲双烯体之间的[4+2]环加成反应被称为逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应(inverse electron demand Diels-Alder reaction,IEDDA).反应生成的中间体具有高度环张力,会迅速脱去一分子氮气,最终生成六元环哒嗪分子(如图9所示)[48].这种反应不需催化剂和外源能量驱动就能直接发生特异性偶联反应,且具有生物兼容性好、反应专一性高和反应速率快的优点,这使得该反应成为最受关注的生物正交化学反应.

图9 逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应机理

2008年,Fox研究组和Hilderbrand课题组分别独立报道了这类IEDDA 反应在生物体系中的应用[49-50].此后,研究者们发展了不同的环式烯烃和四嗪分子衍生物(如图10所示)[51-52],将IEDDA 反应成功应用与荧光物质的“增强(turnon)”和蛋白的定点修饰中.传统方法集中在高度对称的四嗪衍生物,该领域的研究者发现四嗪的3,6位链接吸电子基团时反应效率较高,但是随着深入研究,发现3位和6位的连接基团的选择极为复杂.陈鹏课题组设计了不对称四嗪衍生物,结果表明在3位连接吸电子基团,在6位连接非吸电子基团能够使反应活性与分子稳定性达到最佳平衡,成功地实现了活细胞内的快速生物正交反应[53].此外,Weissleder研究者发现四嗪所连接的酸性基团也会影响反应速率,并提出了“局部酸催化理论”[54].结果表明,在形成双环中间体之后,3位或6位的酸性基团会参与到下一步的异构化反应之中,动力学上利于发生后续消除反应,且基团的酸性越强,反应速率越快.

图10 已报道的参与IEDDA 的主要四嗪分子衍生物

在IEDDA 反应中,最为广泛应用的亲双烯体为反式环辛烯(transcycloctene,TCO).初期研究主要停留在引入给电子基团来提升IEDDA 的反应速率.随着研究的深入,有机化学家发现取代基构象、环张力等因素也对IEDDA 的反应速率有重要影响.Fox研究组利用额外的三元环所产生的张力使TCO 八元环构象改变[48],以更高能量状态的“半椅式”构象存在,显著提升了反应速率.Vrabel课题组研究表明TCO 上取代基构像的不同也会对亲双烯体的反应活性有重要影响,直立构象的羟基作为质子受体协助氢原子异构,从而提高反应效率[52].除了TCO 之外,Chin等研究者发展了基于降冰片烯(norborene)官能团的IEDDA 定点修饰蛋白方法[55],Prescher和叶新山等研究者也利用基于环丙烯与四嗪的IEDDA 反应实现了活体表面糖蛋白的定点修饰与标记[56-57].

在IEDDA 剪切反应中,取代基位于TCO 直立构象时的反应速率也远大于平伏构象时的速率(如图11所示)[58].该剪切反正中,最常用的剪切链接方式为氨基甲酸酯[21].Weissleder课题组提出“氨甲基化”策略,对TCO 分子的剪切链接臂进行氨基烷基化,能够阻断分子内成环对反应速率的影响,从而避免分子内消除成环的副产物,对IEDDA 剪切反应的剪切链接臂的设计提供了新的思路,但是氨基甲基化对剪切释放的活性分子的性能和活性可能有一定的影响,还有待进一步研究.

图11 IEDDA 偶联、剪切反应及具高度环张力的亲双烯体

2.3 Staudinger偶联反应(Staudinger ligation)

2000年,Bertozzi课题组报道了改进型的叠氮和三苯基膦之间的Staudinger偶联反应[59],该反应在水相介质中进行,重排后得到分子内酰胺基氧化膦(如图12所示),被用于细胞表面糖的标记等.此外,该偶联反应生成的氧化膦会调节荧光染料的强度,有着荧光增强或开关(turn on)的特色应用[60],在膦硫酯修饰的多肽的化学偶联、酰化氨基糖、核酸及蛋白质的化学修饰中也有较广应用[61-62].

图12 传统和改进型Staudinger偶联反应

最近,Brase等系统综述介绍了Staudinger偶联反应在生物正交反应中的原理和应用[63].尽管Staudinger偶联反应由于其几乎无生物毒性的反应条件而备受青睐,但需要注意的是由于体内或体外系统中未结合的膦烷-生物素实体的不完全去除,叠氮和膦可能与细胞体内的氧化还原物质(比如自由巯基或者活性氧物质等)发生副反应,这会增强背景荧光,干扰标记的准确性,限制了细胞标记的使用.Prescher等学者系统总结了近20年三苯基膦衍生物在生物正交反应中的发展了应用,彰显了三苯基膦介导的Staudinger反应的多样性和在生物化学尤其是蛋白等标记中的作用[64].

2.4 其它无需金属催化的生物正交反应

除了以上3 类反应之外,醛/酮-羟胺缩合反应(aldehyde/ketone-hydroxylamine condensation reaction)也是一类无需金属催化的生物正交反应,亦被用于蛋白质特异性标记外和药物的靶向运输[65].目前已经有将药物分子偶联在羟胺分子上,通过醛/酮-羟胺缩合反应识别特异性抗原的抗体之上的羰基来达到疾病治疗的目的[66].此外,发生在2-氰基-苯并噻唑(CBT)和半胱氨酸-1,2-氨基硫醇基团之间的半胱氨酸-CBT 缩合反应(1,2-aminothiol CBT condensation)也是一类不需要金属催化的生物正交反应,且能够通过生理条件中的p H、还原剂或者酶进行调控[67],可实现对蛋白质的定点修饰或标记[68-69],在分子影像学和药物靶向输送中也有一定的应用.

3 光催化的生物正交反应

相较于金属催化的生物正交反应,光介导的反应由于其利用外源光的便捷性和可控性,在时间分辨等方面具有天然的优势,近年来得到了广泛的关注.

3.1 紫外光催化的1,3-偶极环加成反应

1,3-偶极环加成反应在无金属催化下也得以成功实现.由于二芳基取代的悉尼酮在紫外光的照射下会快速生成高活性的1,3-偶极中间体,与烯烃发生[3+2]环加成反应,余志鹏课题组通筛选出了高活性二芳基取代悉尼酮,与不同烯烃、炔烃进行组合,构建了多种生物正交偶联反应类型,从而实现对生物体系中不同多肽和蛋白质的选择性标记(如图13所示)[70].

图13 紫外光催化的悉尼酮参与的1,3-偶极环加成

四氮唑在被紫外光照射之后生成的活泼1,3-偶极子,与烯烃快速发生环加成反应,是光点击化学反应的代表性反应之一.荧光化合物被四氮唑修饰之后通常会处于淬灭状态,而当四氮唑与烯烃发生环加成反应之后会恢复荧光.利用这一原理可对特定的蛋白质进行标记.在大肠杆菌与哺乳细胞HEK293 的蛋白中定点插入了含有双键的人工合成非天然氨基酸,然后加入四氮唑修饰的无荧光染料进入细胞(如图14(a)所示).Lin等发现在365 nm 的紫外光照射下,染料在大肠杆菌与HEK293细胞中均恢复相应的荧光,这得益于四氮唑与非天然氨基酸的双键在细胞中的快速环加成反应[71].该课题组还开发了带有含有双环烯烃的效率更高的反应(如图14(b)所示),其二级速率常数高达(1 850±218)L·mol-1·s-1,可以更有效定点标记绿色荧光蛋白[72].

图14 紫外光催化的烯烃参与的1,3-偶极环加成

由于365nm 的紫外光会对细胞造成较大的损伤,Lin研究组成功开发出能用405 nm 波长激光来激活的四氮唑底物,这种四氮唑能与延胡索酸类似物发生快速反应.基于这一反应,该课题组利用延胡索酸修饰的紫杉醇和带染料的四氮唑化合物激光激活,实现了对微管蛋白的实时观察[73].

3.2 可见光催化的生物正交偶联反应

除紫外光外,可见光催化的化学反应在生物大分子的偶联修饰中越来越广.陈以昀课题组报道了一种光催化的自由基偶联反应,N-酰氧基邻苯二甲酰亚胺修饰的底物在可见光的诱导下产生活性自由基,与磺酰苯基修饰的芳香炔发生偶联(如图15(a)所示)[74],且具有较好的生物相容性与特异性(如图15(b)所示)[75].

图15 可见光催化的生物正交偶联反应

张艳课题组报道了可见光催化的菲醌与富电子烯烃的[4+2]环加成光化学反应,这种反应有着较好的专一性和兼容性,可以在生命体系中快速发生.并且可用于小牛血清蛋白的特异性标记,具有一定的时间分辨率,在生物体系中与铜催化的Cu AAC 反应有着良好的兼容性,为在活以内特异性标记蛋白提供了新的策略(如图16所示)[76].

图16 可见光催化的菲醌与富电子烯烃的[4+2]环加成反应

3.3 光催化的生物正交剪切反应

与偶联反应不同,光催化的生物正交剪切反应能实现生物体系内的蛋白质的“化学脱笼”,完成蛋白质的原位激活,极大地方便了生物体内蛋白质组学的研究.目前常用的光控的生物正交剪切反应是以紫外光催化的邻硝基苯的脱除反应.同时也不断有新的光催化的生物正交剪切反应被开发.例如陈以昀课题组开发了一种以荧光素为介质,紫外光催化为条件的硼酸频哪醇酯脱笼反应,该反应已被用于多种活细胞中[77].除紫外光、可见光等光催化条件外,刘志博等开发了辐射驱动的生物正交剪切反应.用二羟基苄基碳酸酯保护的活性分子能够与辐射产生的羟基自由基发生反应,进而脱除二羟基苄基碳酸酯,释放活性分子[78].利用这一原理,可以将抗癌药物进行修饰,与外源性辐射相结合,可以在肿瘤细胞内精确地释放药物,减轻抗癌药物的毒性.同时也可以将荧光分子进行修饰,控制其在生物体系中的定点释放(如图17所示).

图17 辐射介导的生物正交剪切反应

4 生物正交反应在药学研究中的应用

4.1 生物正交反应在活性药物分子发现中的应用

在生物体内,小分子在特定作用器官或病灶位点的原位自组装是一种发现药物活性分子的极具优势的潜在方法[79].利用生物正交反应尤其是叠氮和末端炔基之间的环加成反应把两个药物片段原位连接,可用于设计靶点蛋白的抑制剂(如图18所示)[80].利用这种方法,研究者们通过库筛选的方法获得了活性较好的乙酰胆碱酯酶、碳酸酐酶等酶抑制剂[81].

图18 原位叠氮和末端炔基环加成反应用于靶点抑制剂的发现

作为生物正交反应中反应速率最快的反应,逆电子需求的狄尔斯-阿尔德(IEDDA)反应可在细胞中用于发现活性药物分子[82],Astex Pharmaceutical公司的研究表明,四嗪和反式环辛烯介导的反应可以在活细胞中将BRD4 或ERK1/2 抑制剂与E3 连接酶CRBN 的配体thalidomide连接起来(如图19所示),能够快速优化连接方式得到活性很好的PROTACs分子[83].

图19 IEDDA 反应用于靶点抑制剂的发现

4.2 生物正交反应在靶向药物递送和前药设计与激活中的应用

除了在细胞中筛选活性分子之外,生物正交反应在疾病的靶向药物递送尤其是在活体中前药的递送和激活中有着广泛的应用,这主要得益于生物正交剪切反应或者click-to-release 反应的发展.2014 年Bradley和Uniciti-Broceta等首次利用具有生物相容性的零价钯树脂在斑马鱼的胚胎卵黄囊中催化剪切释放出荧光探针[84],这个研究直接促进了4 年后Weissleder等在小鼠体内利用Pd纳米材料催化释放阿霉素的研究[85],由于该Pd纳米材料能有效地在肿瘤部位累积,这种策略可以极大降低阿霉素的毒副作用.Pd催化的生物正交剪切反应也可用于微针药物递送等领域.最近,Gu研究组开发了一款能够实现化疗药增效减毒的生物正交催化贴剂(Bioorthogonal Catalytic Patch)(如图20所示),将其贴在小鼠黑色素瘤周皮肤上,明显减慢了肿瘤增殖速度[86].

图20 IEDDA 剪切反应在阿霉素药物的激活和释放应用

除了Pd催化的生物正交剪切反应,基于IEDDA的生物正交反应也被用于癌症等疾病的靶向药物递送和治疗中[87].与IEDDA 偶联反应不同,IEDDA 剪切反应可以使被临时修饰而失去活性的分子恢复活性,因此可被用于前药的激活研究中.Robillard等早在2013年便报道了利用IEDDA 剪切反应来激活阿霉素前药的研究[88].他们以氨基甲酸酯为连接方式将TCO 连接在阿霉素上制成毒性较小的前药,与四嗪分子反应之后生成阿霉素和CO2分子,从而实现前药的激活.Xie等将阿霉素前药装载入肿瘤微环境响应的纳米载体,在肿瘤部位精准释放后,与包裹在纳米载体中的四嗪快速反应从而实现化学脱笼释放前药(如图21所示),因此可用于肿瘤的治疗[89].

图21 IEDDA 剪切反应在阿霉素药物的激活和释放应用

除了靶向递送小分子前药之外,生物正交剪切反应也可用于蛋白药物的靶向递送.Haag等通过IEDDA 偶联制备了一种pH 响应型纳米凝胶,把具有显著抗肿瘤作用的天冬酰胺酶高效包裹,该纳米药物到达肿瘤部位后,由于微环境的差异在肿瘤部位靶向释放药物[90],这是一种先进的智能抗肿瘤药物(如图22所示),也可解决蛋白药物稳定性差的问题[91].

图22 IEDDA 应用于靶向药物输送和治疗

4.3 生物正交反应在药物靶点研究中的应用

活性分子的靶点发现和选择性研究在药物化学中尤为重要,传统方法都是在体外进行的.得益于生物正交反应独特的反应选择性和反应速率,研究者可以在细胞中原位进行药物靶点发现和药物动力学研究.Weissleder课题组将连有TCO 的PARP1 抑制剂奥拉帕尼与细胞共孵育之后,可用连有四嗪的树脂将其它与奥拉帕尼可能结合的蛋白捕获(如图23所示),进而通过质谱等手段确定所结合的蛋白[92].

图23 IEDDA 应用于药物靶点捕获和验证

Yao研究组发展了一种同时含有能原位参与光亲和标记基团-活性导向的蛋白谱学分析技术(photoaffinity labeling group-activity-based protein profiling,PLG-ABPP)和IEDDA 反应的双功能化学探针,在肝细胞Hep G2中成功实施了蛋白质组分析(如图24所示),极大提高了(+)-JQ1的脱靶性研究可靠性[93].

图24 基于IEDDA 的双功能化学探针应用于药物靶点发现

4.4 生物正交反应在抗体-药物偶联物中的应用

单克隆抗体在抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugates,ADC)和肿瘤治疗中越来越重要,已有多个ADC被FDA 批准或正在临床实验中[94].但是其本身清除速率非常慢,对ADC 药物尤其是放射药物的临床应用极为不利,此外,传统ADC对于肿瘤细胞表面低表达相关受体的肿瘤治疗效果不好.Robillard等首先将四嗪与TCO 之间的IEDDA 剪切反应用于设计在肿瘤位点递送阿霉素的ADC88,该课题组也设计了能够选择性释放微管蛋白抑制剂(monomethyl auristatin E,MMAE)的ADC,这类非内吞型的ADC在释放MMAE前选择性富集在肿瘤细胞表面,而在正常健康组织里的保留时间非常短.加入TCO后,MMAE快速释放并可被动浸入附近的癌细胞(如图25所示),这对于杀死不表达或低表达表面受体的癌细胞尤为重要[95].Liu和Shao等发现三氟化硼基团硼氨酸(Phe-BF3)可以使酚羟基上的硅烷选择性脱除(如图26所示).采用这种新型的生物正交剪切反应,他们制备了新的ADC即trastuzumab-MMAE,向体系中加入具有肿瘤靶向功能的Phe-BF3 探针后,在肿瘤组织中高浓度原位释放MMAE[96].利用同样的生物正交策略,他们将携带Gasdermin蛋白的纳米颗粒递送在肿瘤组织并对细胞凋亡过程进行了原位调控,进一步激活了T 细胞介导的抗肿瘤免疫反应,这个原理验证(proof of principle)研究为肿瘤免疫治疗药物的开发提供了新的技术手段.

图25 IEDDA剪切反应在选择性释放MMAE的ADC中的应用

图26 IEDDA 剪切反应在ADC中的应用

生物正交反应尤其是IEDDA 和SPAAC反应在预靶向放射免疫治疗(pretargeting radioimmunotherapy,PRIT)和放射性物质预靶向成像(pretargeting imaging)中也有越来越多的应用.Zeglis等首次利用IEDDA 反应将5B1-TCO 单抗静脉注射在胰腺癌肿瘤组织,72 h 后注射177Lu-DOTA-PEG7的四嗪衍生物,结果表明肿瘤体积明显减小(如图27 所示)[97].该研究组在后期的工作中利用hu A33-TCO单抗和177Lu-DOTA-PEG7-Tz的IEDDA 反应甚至发现这种策略在小鼠结肠模型中可获得100%的存活率[98].

图27 IEDDA 剪切反应在预靶向放射免疫治疗中的应用

传统放射性物质成像中,带有放射基团的ADC本身清除速率非常慢.如果先给小鼠注射带有生物正交反应官能团的非放射性抗体,在其到达作用部位和合适的时间点时,再加入带有四嗪的放射性小分子,二者可快速反应并在指定位点成像(如图28所示)[99],该策略能解决放射性药物清除速率慢的问题.

图28 IEDDA 剪切反应在放射性ADC中的应用

5 总结与展望

生物正交反应为化学生物学发展和研究生命进程带来了革命性的技术方法,为该领域的核心研究策略之一.过去的20年见证了众多研究团队对Cu AAC,SPAAC,IEDDA 等反应的机理、反应速率、反应前驱体的设计等进行的深入研究.由于其高度的专一性、较高的反应速率和良好的生物兼容性,生物正交反应在细胞和动物中有着越来越多的应用.研究者们可以对蛋白质、核酸、脂质、糖等生物大分子定点修饰进而成像,也可以对细胞、组织和活体动物等不同层面的生物结构进行观测.

近年来由于药物耐药性问题的不断出现,快速发现新的活性药物骨架和新型疾病相关靶点抑制剂等方法备受关注.生物正交反应已经在激酶如乙酰胆碱酯酶抑制剂的发现中逐渐崭露头角,也加速了PROTACs连接方式的优化.在疾病尤其是肿瘤的靶向治疗中,生物正交剪切反应也受到了药学研究者的青睐,既可以用于蛋白药物的靶向递送,也对小分子药物在肿瘤部位的富集和渗透起到了极大的促进作用,从而提高了其治疗效果并能降低药物毒性.不仅如此,生物正交反应对于在细胞中原位进行药物靶点发现和药物动力学研究也有重要意义,也可以与蛋白谱学分析技术相结合,提高药物脱靶性研究的可靠性.

在当今生物正交反应面临反应新拓展和应用新升级的关键时期,研究效率更高、原料更加易得、相互正交性和生物兼容性更好的反应类型仍然是个长期挑战,尤其是用于活体动物的生物正交反应升级更加迫切和艰巨.技术为应用而生,如何将这些革命性的技术应用在解决生命科学和原创新药发现中,是生物正交反应的下一个重要发展方向.期待生物正交反应在临床诊断、小分子药物、蛋白质前药和ADC等药学领域中有更加广阔和有效的应用前景.