莼菜不同组织内生细菌多样性的比较分析

张秋玉，陈晶，周雪妹，龚汉雨，余光辉

（中南民族大学 生命科学学院&中国莼菜研究所&武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉 430074）

莼菜（Brasenia schreberi），睡莲科莼属，为多年生浮叶植物，是中国传统的药食兼用型珍贵蔬菜.我国莼菜以湖北利川、浙江杭州的莼菜最为著名［1］.莼菜嫩芽外包被有一层透明胶质，其主要成分是多糖［2］，也是莼菜嫩芽药用价值的主要来源.目前莼菜种群多为人工维护的半自然栽培种群，为中国国家Ⅰ级保护濒危野生植物.

目前关于内生菌的研究，多数为土壤根际间微生物的群落结构分析.内共生菌的种类丰富度因环境的变化和植物体不同器官呈动态变化特征.BERTANI等［3］从淹水和干旱条件下的水稻根、叶和茎中分离得到内生菌，发现淹水条件下的水稻比干旱条件下的水稻体内具有更多的内生菌.

莼菜作为水生浮叶植物，其不同组织间的内生细菌群以及和水中的微生物群间的对比未有报道.莼菜对生存环境有着较高的要求和独特的适应力，与其对内生细菌种群的选择有着密切的关系.本文拟对莼菜不同组织内生细菌的群落结构进行初步分析，探讨莼菜环境适应的机理.

1 材料与方法

1.1 样品采集

样品采自湖北省利川市佛宝山莼菜种植基地.在莼菜生长旺盛期采集其嫩芽、茎、叶组织及种植田水样（莼菜生长环境）各4个样品，共16个样品.水样采用三点取样法取样，取中层水.组织样品分别放入无菌袋，封装，低温保鲜带回实验室.采集的三点水样混合摇匀后取80 mL分装在两个50 mL的离心管.液氮速冻，-80℃保存.

1.2 莼菜样品表面无菌化处理

将莼菜嫩芽，茎，叶用无菌水缓流冲洗2 min，75%乙醇洗涤3 min，再用无菌水洗涤植物组织6次，分别保存于无菌管中，标记为莼菜嫩芽（bud）、莼菜茎（stem）、莼菜叶（leaf）、种植水样（water），每种样品4次重复，-80℃保存.将最后一次洗涤水取100µL涂无抗LB平板，28℃，光照12 h/d培养，用以检测灭菌效果.

1.3 微生物DNA提取和测序

主要流程为：（1）提取莼菜样本微生物组总DNA，同时采用Nanodrop对DNA进行定量，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量.（2）选择16S rRNA基因V3-V4区，以5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′为正向引物序列，5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3′为反向引物序列，并添加样本特异性Barcode序列和全式金公司的Pfu高保真酶进行PCR扩增.（3）PCR产物使用磁珠（Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads）进行纯化，保存在干净的1.5 mL离心管中.（4）将PCR扩增回收产物进行荧光定量，荧光试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为Microplate reader（FLx800，BioTek）.根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合.（5）使用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit构建文库，并进行质检.（6）合格的文库使用MiSeq测序平台进行双端测序.莼菜样本测序由上海派森诺完成.

1.4 生物信息分析

测序原始数据以FASTQ格式保存.使用DADA2方法［4］对所有样品的全部原始序列（Input）进行矫正.采用Vsearch软件，按照97%的相似性阈值将序列划分为不同的分类单元（operational taxonomic units，OTU），从每个OTU中选择一条作为代表序列，通常被视为一个微生物物种［5-6］.采用稀疏（Rarefaction）的方法进行抽平，深度设为最低样本序列量的95%.在QIIME2软件中选用Greengenes数据库（http：//greengenes.secondgenome.com/）进行物种注释［7］.使用QIIME2软件计算Alpha多样性指数，Beta多样性距离矩阵，通过非量度多维尺度分析（Non-quantitative multidimensional scaling analysis，NMDS）方法评估Beta多样性差异.利用QIIME2软件、R软件绘制分类水平下的共生菌菌群的相对丰度柱形图，分析群落结构组成.利用PICRUSt2（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）对内生菌进行功能预测分析，通过对比数据库（https：//www.kegg.jp/），使用MinPath推断代谢通路的存在，进而获得各样本代谢通路中相关基因的丰度数据.

2 结果

2.1 16S rRNA序列测定数据质量

所有植物样品的对照平板培养一周后没有菌落长出，说明样品表面消毒彻底.通过质量初筛的原始序列按照Index和Barcode信息进行文库和样本划分，并去除Brcode序列后，16个样品测序后得到1254273条序列，对所有样品的全部原始序列（Input）进行质量控制（Filtered），去噪（Denoised），连接（Merged）并且去嵌合体（Non-chimeric），获得高质量序列1124709条.莼菜微生物总DNA经16S rRNA V3-V4区特异性PCR扩增，PCR产物测得的序列在删掉两端引物序列和结合不好的序列后，序列长度为410 bp.由图1可见，总体符合扩增序列长度，且集中度较好.

图1 莼菜微生物扩增序列长度特征Fig.1 Length characteristics of sequences of entophytic bacteria of Brasenia schreberi

2.2 莼菜内生细菌菌群多样性分析

基于97%相似性的分类水平，由图2可见，从样品中共获得1391个细菌OTUs，莼菜不同组织间和与生长环境间的OTUs数量存在差异.莼菜种植水样中OTUs最高，达535个；莼菜嫩芽中内生细菌OTUs数为242个；茎中内生细菌OTUs数为414个；叶中最少，内生细菌OTUs数为200个.莼菜嫩芽、茎、叶和水样4种样品里有19个共有的OTUs；水样和嫩芽中有56个共有的OTUs；水样和茎中有57个共有的OTUs；水样和叶中有35个共有的OTUs；嫩芽和茎中有41个共有的OTUs；嫩芽和叶中有46个共有的OTUs；茎和叶中有63个共有的OTUs.可见，莼菜植物体和种植水样中均含有丰富的内生细菌种类，种植水样品中内生细菌群多样性大于植物样品菌群，且在莼菜组织中茎的内生细菌群更为丰富，表明莼菜的茎与生长环境接触更密切，可能与生长环境所共享的内生细菌更多，彼此共有的内生细菌种类更丰富，因此莼菜各部位的内生细菌群落结构与各部位所在环境有着密切关系.

图2 莼菜不同部位和水样微生物OTUs的分布Fig.2 Distribution of microbial OTUs in different organs of Brasenia schreberi and water

基于OTU的稀疏曲线结果见图3，随着测序数的增加，稀释曲线逐渐趋于平坦，可认为测序深度能够基本覆盖到样品中绝大多数物种.而水样的稀疏曲线未开始趋于平缓，更大深度的测序可能会显示出更多的OTUs.

图3 α稀疏曲线Fig.3 Alpha rarefaction curves

根据Alpha多样性指数分析（表1），莼菜不同组织和水样中的内生细菌多样性具有显著差异.Chao1指数反映内生细菌群落丰富度（community richness），从大到小排列为水样＞茎＞嫩芽＞叶，样本间具有差异（0.01≤P≤0.05）.Shannon指数反映内生细菌群落丰富度和均匀度，从大到小排列为水样＞茎＞嫩芽＞叶.从表1可以看出，莼菜种植水样中的内生细菌群落多样性比植物组织更加丰富.在莼菜不同组织中，茎的内生细菌群落多样性更为丰富.Beta多样性分析中NMDS分析结果见图4，莼菜不同组织、水样的菌群结构之间的差异具有解释意义（stress=0.126），且嫩芽、茎、叶与水样间细菌菌群结构存在显著差异.因此，OTU丰富度依赖于植物的 不同组织和生长环境.

表1 莼菜内生细菌Alpha多样性指数Tab.1 Alpha diversity index of entophytic bacteria of Brasenia schreberi

图4 莼菜内生细菌菌群Beta多样性分析Fig.4 Beta diversity analysis of entophytic bacteria of Brasenia schreberi

2.3 莼菜内生细菌群落结构组成分析和差异分析

根据测定的1391个内生细菌OTUs，属于21个门和399个属.从图5可见，在门（phylum）水平上，种植水样和莼菜组织间的内生细菌所测得的门种类相似，但在不同生态位中所占比例不同.主要有以下4种优势菌门，变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes），其中变形菌门（Proteobacteria）在所有样品中占主要优势.另外，在水样中疣微菌门（Verrucomicrobia）的相对丰度占比均高于莼菜各组织，达9.48%；嫩芽中不含绿弯菌门（Chloroflexi），而在茎中的相对丰度占比（1.77%）均高于水样和叶.

图5 莼菜内生细菌门水平的相对丰度Fig.5 Relative abundance of entophytic bacteria at phylum level of Brasenia schreberi

从属的分类水平上分析见图6，对每种样本的最大丰度排名前20的属统计，嫩芽样本中相对丰度占比大于2%的菌属包括假单胞菌属（Pseudomonas，11.71%）、不动杆菌属（Acinetobacter，11.34%）、双歧杆菌属（Bifidobacterium，9.42%）等9个菌属.茎样本中相对丰度占比大于2%的菌属包括嗜冷杆菌属（Psychrobacter，13.46%）、泉发菌属（Crenothrix，4.71%）、伯克氏菌属（Burkholderia，3.86%）、弧菌属（Vibrio，2.97%）等7个菌属.叶样本中相对丰度占比大于2%的菌属包括其他根瘤菌属-新根瘤菌属-副根瘤菌属-根瘤菌属（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium，16.81%）、伯克氏菌属（Burkholderia，8.57%）、不动杆菌属（Acinetobacter，2.63%）等6个菌属.水样中相对丰度占比大于2%的菌属包括多核杆菌属（Polynucleobacter，15.91%）、

图6 莼菜内生细菌属水平的相对丰度Fig.6 Relative abundance of entophytic bacteria at genus level of Brasenia schreberi

FukuN18_freshwater_group（8.57%）、Rhodoluna（5.43%）等8个菌属.水样和莼菜组织间中共有29个共有菌属，占内生细菌所有种类的7.27%.

根据LEfSe物种分类等级分析结果见图7显示，在水样本中衣原体门（Chlamydiae）具有相对优势，在茎样本中绿弯菌门（Chloroflexi）具有相对优势，在叶样本中变形菌门（Proteobacteria）具有相对优势.在属水平上，水样本中占相对优势的有芽孢杆菌属（Bacillus）、Sediminibacterium、栖水菌属（Enhydrobacter）、黄杆菌属（Flavobacterium）、军团菌属（Legionella）；在茎样本中占相对优势的有Methylotenera、SWB02、红长命菌属（Rubrivivax）；在叶样本中占相对优势的是其他根瘤菌属-新根瘤菌属-副根瘤菌属-根瘤菌属（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）；在嫩芽样本中占相对优势的是Obscuribacterales.分析结果表明：具有相对优势的10个菌属对4种样本间差异具有显著性影响（LDA分值＞2）.

图7 莼菜内生细菌菌群差异分析Fig.7 Analysis on the difference of entophytic bacteria in Brasenia schreberi

2.4 莼菜内生细菌菌群宏基因组功能预测

利用PICRUSt2分析软件，通过对比KEGG数据库，对莼菜组织内生细菌进行初步的功能预测.从图8可见，获得了与莼菜微生物生态系统功能密切相关的6类第一等级生物代谢通路功能，包括代谢、遗传信息处理等.其中代谢相关基因丰度最高，为内生细菌最主要的功能；其次为遗传信息处理、细胞进程、环境信息处理通路；生物体系统和人类疾病通路的相关基因丰度较小，因此这两个通路不是莼菜内生细菌的主要功能.

图8 KEGG功能通路丰度图Fig.8 Abundance map of KEGG functional pathway

上述生物代谢通路可以进一步细分为第二等级功能，共包含34个子功能.其中代谢通路中的功能基因丰度最大的为碳水化合物代谢，其次为氨基酸代谢、辅酶维生素代谢、异生素降解与代谢；遗传信息处理通路中功能基因丰度最大的为DNA复制与修复，其次为折叠、分类和降解、翻译、转录；细胞进程通路中其丰度最大为细胞运动，其次为细胞生长与死亡；环境信息处理通路中最大为膜运输.

3 讨论

以前研究通常利用微生物分离、培养和鉴定的方法来研究其多样性，不能准确地分析菌群结构［8］.随着测序技术的进步，基于微生物16S rRNA基因的高通量测序能高通量、高准确度地处理大批数据，被广泛应用于微生物生态学领域［9-11］.本实验利用Illumina MiSeq高通量测序技术分析16S rRNA，从基因水平分析了莼菜微生物的群落结构.分析结果显示种植水样的OTU丰富程度远远高于芽、茎、叶；在莼菜组织中，茎的内生细菌多样性大于其他组织.虽然植物样品含有较少的内生细菌总数，但内生细菌种类很丰富，此外内生细菌群落组成的分布依赖于植物的不同组织.

本研究发现莼菜内生细菌的优势菌门为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门，与其他植物内生菌的优势菌门相似［12］.变形菌门细菌均为革兰氏阴性菌，大多数细菌营兼性或专性厌氧及异养或自养化能生物生活，有研究认为变形菌门的丰度越大，其中的有机质和C、N养分含量就越多.厚壁菌门多数为革兰氏阳性菌，包括厌氧的梭菌纲（Clostrida）、兼性或者专性好氧的芽孢杆菌纲（Bacilli）、Erysipelotrichia、Negativicutes等.放线菌门是革兰氏阳性细菌，可以降解不溶性有机物质.这些菌门下属纲的特征预示着莼菜微生物具有丰富的菌落多样性.进一步统计相对丰度占比大于2%的菌属，嫩芽样本中包括嗜糖假单胞菌属、不动杆菌属、双歧杆菌属等9个菌属.茎样本中包括嗜冷杆菌属、泉发菌属、伯克氏菌属、弧菌属等7个菌属.叶样本中包括根瘤菌属、伯克氏菌属、不动杆菌属等6个菌属.水样中包括多核杆菌属、FukuN18_freshwater_group、Rhodoluna等8个菌属.水样和莼菜组织中有29个共有菌属，说明莼菜组织存在主动富集菌群的可能，并且共有菌属作为基础菌属在莼菜组织中起着重要作用.如假单胞菌属的一些菌株可以分泌生长素和抗生素，促进植物的生长、提高植物的免疫力以及抑制多种致病菌活性［13-14］.伯克氏菌属的一些细菌具有生物防治［15］、促进植物生长［16］和生物修复［17］等功能.莼菜不同组织的内生细菌群落结构不同，在门水平和属水平上均有差异，如在莼菜的茎样本中绿弯菌门（Chloroflexi）的相对丰度占比均高于水样、叶和嫩芽，为茎中的显著标志物种.由于莼菜的茎一直处于水中，且绿弯菌门的细菌能通过光合作用固碳，因此能为莼菜茎的生长提供能量.在茎样本中嗜冷杆菌属的相对丰度最大.结果表明莼菜内生细菌功能与其结构相适应，组织间的内生细菌差异有助于其特异性功能的实现.

微生物的群落结构受到环境特性、群落特征等外界因素及自身遗传物质的内在因素的共同影响.对莼菜内生细菌潜在功能进行预测发现，代谢通路相关功能基因的丰度最大，成为内生细菌群落最主要的功能.且在其第二等级通路中的功能基因丰度较大的为碳水化合物代谢和氨基酸代谢，说明莼菜内生细菌的优势功能主要集中在碳、氮两种元素的分解转化，为细菌生存提供保障.由于莼菜植物体大部分位于水中，可能会受到水的胁迫，因此莼菜内生细菌丰富的代谢功能，能协助莼菜抵抗环境的影响.

本研究仅针对莼菜内生细菌群落结构及多样性特征，其不同组织间内生细菌群落差异可能与植物不同组织生理结构有关.但这些菌群对莼菜的发育及其外周多糖的影响尚不清楚，应进一步开展这些菌群功能的研究，为莼菜的内生细菌资源挖掘和可持续农业生产奠定更好的理论基础.