络石藤中3个化合物与P38αMAPK 靶酶的分子对接研究

张 铭,张 莉,冉 挺,段绪红,赵聪格,魏计超,苏彦雷

1.石家庄平安医院药械科,石家庄 050000;2.厦门大学药学院,厦门 361102;3.河北中医学院药学院,石家庄 050200;4.解放军第260医院药械科,石家庄 050041;5.河北医科大学第三医院,石家庄 050001;6.中国人民解放军联勤保障部队第九八〇医院临床药学科,石家庄 050082

络石藤始载于《神农本草经》,被列为上品,为抗风湿中药,化学成分包括木质素类、黄酮类、萜类、生物碱类等化合物,现代药理实验也证实其具有抗炎作用[1-2]。查阅石家庄平安医院2019年～2020年治疗类风湿的中药处方,分析后发现中药络石藤的临床应用频率较高,此外,一些抗风湿中成药如通络开痹片、舒筋活血胶囊等处方中也均含有络石藤,但络石藤相关的药理研究报道多为粗提物,其发挥抗炎作用的药效物质基础并未被明确阐释。本研究选取络石藤中牛蒡子苷元、牛蒡子苷、络石苷元B为目标化合物,以炎症信号转导中的关键激酶P38αMAPK 为研究靶点[3-11],参照其抑制剂SB-203580[12-13]、BIRB-796[14-17]与靶酶的分子间相互作用模式,利用分子对接软件Autodock Vina探究牛蒡子苷元、牛蒡子苷、络石苷元B与P38αMAPK的分子间作用结合模式。实验发现,牛蒡子苷元、牛蒡子苷与标靶蛋白活性位点存在较强的相互作用,而络石苷元B的相互作用较弱以至于不能稳定地占据该活性位点,故络石苷元B对P38αMAPK 激酶无相关抑制作用。牛蒡子苷元和牛蒡子苷可竞争性阻断靶酶活性位点与三磷酸腺苷（ATP）的结合,抑制靶酶的生物学活性,从而阻断P38αMAPK 介导的炎症通路信号转导,抑制炎症因子的生成,发挥抗炎药理作用,本研究结果与牛蒡子苷元、牛蒡子苷的抗炎药理实验结果相一致。牛蒡子苷元和牛蒡子苷应该是中药络石藤发挥抗风湿作用的活性代表成分,二者可能通过抑制P38αMAPK 炎症通路而发挥抗炎药理作用。本研究从分子间相互作用层面阐释了二者的抗炎机制,研究得出了牛蒡子苷元、牛蒡子苷抗炎药理作用的一个重要靶点,亦为具有抗炎活性的新型p38α激酶抑制剂的设计提供了新的参考,值得进行深入研究。

1 实验方法

1.1 小分子配体及靶标蛋白的选择

在分子对接实验过程中,选取络石藤中的牛蒡子苷元、牛蒡子苷、络石苷元B为分子对接的配体（见图1）,设定经典抑制剂SB-203580、BIRB-796为阳性对照配体,用以验证对接方法的科学性和可靠性,进行与P38α的分子对接。小分子配体的化学结构见图1。

图1 小分子配体的结构Fig.1 The structures of smalll molecule ligands

P38MAPK激酶家族中的α亚型主要与炎症信号转导有关,是近30多年来研究的一个重要抗炎靶点。P38αMAPK结构中含有多个与底物分子结合的空腔结合位点[18-21],如底物ATP 占据了靶酶结构中的AB、SB、PB区域,抑制剂SB-203580则占据P38αMAPK 的AB区域、HP Ⅰ疏水区域、PB 区域;抑制剂BIRB-796占据HP Ⅰ疏水区域、HPⅡ区域、SP 区域、PB区域以及Phe169苯丙基移动大约10Å[22]后所暴露的变构疏水口袋,BIRB-796吗啉环上氧原子与靶酶Met109形成氢键,其脲上的氧原子与Asp168残基形成氢键相互作用,脲中的氢原子与Glu71形成氢键相互作用,叔丁基结合在了变构疏水口袋,倘若将BIRB-796的叔丁基换为甲基则活性降低1 000倍以上。靶酶与SB-203580共结晶所得结构为1A9U,称为DFG-in构象;与BIRB-796 共结晶所得结构为1KV2,称为DFG-out构象。1A9U 与1KV2是同一蛋白的2 种不同构象,将两者结构进行三维空间上的叠合,区别仅在于1KV2较1A9U 多出一个便于底物结合的疏水空腔,即DFG-out构象中Phe169的苯环从亲脂口袋外翻并指向了ATP 结合区域从而暴露出了变构疏水口袋,DFG 基序所在的活化环域（A-loop）略微向外翻腾。见图2。此外,分析发现,HPⅠ疏水区域由Val38、Ala51·12345678s53、Leu75、Leu104、Thr106等组成[23-25],HPⅡ空腔区域由Val30、Ala40、Ile84、Leu108、Ala111、Asp112、Met109 等组成[24,26],变构疏水口袋由Leu74、Met78、Val83、Ile141、Ile166 等组成[27]。

图2 1KV2与1A9U 的三维结构叠合Fig.2 The overlap of three dimensional structure between 1KV2 and 1A9U

考虑配体分子的柔性变化和体积较大,故选定1KV2 为本研究中进行分子对接的靶标蛋白,将BIRB-796、牛蒡子苷元、牛蒡子苷、络石苷元B 与其进行分子对接研究,此外,将SB-203580与1a9u进行分子对接实验,2个阳性对照配体的实验结果分别与原有结合构象进行三维空间的叠合用以验证对接方法是否具有科学性、可靠性。

1KV2三维结构主要由8个α螺旋、9个β折叠及无规卷曲组成,有生物学活性作用的位点主要由β折叠及2个螺旋及无规卷曲组成。蛋白疏水的沟槽位于蛋白的表面,小分子抑制性配体结合于此活性位点妨碍正常底物的进入与结合,从而起到阻断炎症信号通路传导的作用。

1.2 分子对接及运算过程

本实验的研究方法采用笔者之前报道的实验方法[28]。

1.2.1 配体处理 利用Chemdraw 14.0处理小分子的结构,采用MM2力场进行能量最小化优化保存成mo12格式,用MGLTools1.5.6处理,通过加氢,计算电荷及合并非极性氢后保存成pdbqt文件。

1.2.2 受体处理 从PDB 数据库获得蛋白三维结构,用MGLTools1.5.6处理蛋白结构,通过加氢、计算电荷、合并非极性氢后保存成pdbqt文件。

1.2.3 利用分子对接软件Autodock Vina进行对接处理 以蛋白的活性位点（centerx=33.326,centery=33.725,centerz=17.372）为中心,构建一个60×40×60的盒子,通过Vina运算生成pdbqt文件。

1.2.4 结果处理 Py MOL1.7.2.1 软件打开生成pdbqt文件,并打开1KV2蛋白结构,保存成复合物pdb文件,并进行相关作图处理与分析。

2 分子对接的结果及分析

2.1 阳性化合物的对接结果

实验研究结果显示,SB-203580 和BIRB-796 均结合于原活性位点处,配体BIRB-796的对接构象与原晶体构象叠合时,均方根偏差（RMSD）计算为0.426Å,配体SB-203580的对接构象与原晶体构象叠合时RMSD 计算为0.867,均小于2,说明对接结果是相对可靠的。见图3和图4。此外,BIRB-796、SB-203580 对接时产生的结合能分别为-11.0、-8.9 kal·mol-1,说明BIRB-796 与P38αMAPK 的结合能力强于SB-203580,这也与实际药理实验中BIRB-796对P38α的抑制活性明显强于SB-203580的实验结果[27]一致。

图3 BIRB-796与靶标蛋白1KV2的对接配体对接构象（绿）与原晶体构象（紫）叠合Fig.3 The docking conformation （green）of BIRB-796 with the docking ligand of the target protein 1KV2 overlaps with the original crystal conformation （purple）

图4 SB-203580与靶标蛋白1A9U 的对接配体对接构象（绿）与原晶体构象（紫）叠合Fig.4 The docking conformation （green）of SB-203580 with the docking ligand of target protein 1A9U overlaps with the original crystal conformation（purple）

2.2 目标化合物对接结果

通过分析Vina对接结果发现,牛蒡子苷元、牛蒡子苷、络石苷元B 与p38αMAPK 的上述结合位点产生一定的相互作用,小分子配体结合于1KV2蛋白,以pymol作图,蛋白以cartoon形式显示,对接结果见图5。

图5 牛蒡子苷元（1）、牛蒡子苷（2）、络石苷元B（3）结合于1KV2的示意图Fig.5 The binding mode of arctigenin（1）,arctiin（2）,trachelosperogenin B（3）with 1KV2

通过分析Vina对接结果发现,牛蒡子苷元配体主要通过疏水、范德华力结合于1KV2结构中的活性位点,主要与Lys53、Arg70、Glu71、Leu74、Leu75、Met78、Val83、Ile84、Ile146、Ile147、Arg149、His148、Ile166、Leu167、Asp168、Phe169 等氨基酸残基发生相互作用（见图6）,推测牛蒡子苷元占据了p38α的PB区域、变构疏水口袋及其他新区域,与1KV2靶点蛋白对接产生的能量为-8.3 kal·mol-1。

图6 牛蒡子苷元配体结合1KV2蛋白（a）与结合二维平面（b）示意图Fig.6 The docking of arctigenin with 1KV2（a）and 2D view of binding mode（b）

牛蒡子苷配体主要通过疏水、范德华力结合于1KV2结构中的活性位点;主要与Tyr35、Leu55、Arg70、Glu71、Leu74、Leu75、Met78、Val83、Ile84、Ile146、Ile147、His148、Arg149、Leu167、Asp168、Phe169、Glu328等氨基酸残基发生相互作用（见图7）,小分子配体的羟基氢和Glu71氧原子形成氢键,键长为2.7Å;糖环上的氢与Phe169上的氧形成氢键,氢键键长2.5Å,推测牛蒡子苷占据p38α的PB区域、变构疏水口袋及其他新区域,对接能量为-8.0 kal·mol-1。

图7 牛蒡子苷配体结合1KV2蛋白（a）与结合二维平面（b）示意图Fig.7 The docking of arctiin with 1KV2（a）and 2D view of binding mode（b）

络石苷元B 配体主要通过疏水、范德华力结合于1KV2结构中的活性位点;主要与Arg67、Arg70、Glu71、Leu74、Leu75、Met78、Val83、Ile84、Ile146、Arg149、His148、Ile166、Leu167和Asp168等氨基酸残基发生相互作用（见图8）,小分子配体的羟基氢和Asp168氧原子形成氢键,键长为2.1Å;与His148上的N 形成氢键,键长为2.2Å,推测络石苷元B 占据p38αMAPK 的变构疏水口袋及其他新区域,对接能量为-4.4 kal·mol-1。

图8 络石苷元B配体结合1KV2蛋白（a）与结合二维平面示意图（b）Fig.8 The docking of collagenin B with 1KV2（a）and 2D view of binding mode（b）

3 结论

P38MAPK（α亚型）是一个国际公认的介导炎症通路信号传递的激酶,至今已有几十年的研究历史,对P38α激酶进行抑制可减少炎症因子生成从而产生抑制机体炎症反应的作用,例如SB-203580、BIRB-796等P38αMAPK 抑制剂均可在细胞水平降低LPS刺激而诱导多种炎症因子（包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等）的生成,但多个P38α激酶的强效抑制剂均以临床试验失败而告终,原因在于P38α激酶的生物学作用广泛,所以P38α激酶的弱作用抑制剂或者其下游炎症通路的激酶可能应该更适合作为研究抗炎作用的方向。本研究通过分子对接手段发现,牛蒡子苷元和牛蒡子苷均是以非共价键结合方式作用于靶蛋白P38α的PB区域活性位点、变构疏水口袋,均能竞争性的抑制P38α靶酶从而抑制该酶下游底物分子的活化,阻碍炎症通路信号转导起到抗炎作用,且二者对接结合能与SB-203580相接近,推测牛蒡子苷元和牛蒡子苷对P38αMAPK 的抑制活性极可能与SB-203580相近。络石苷元B占据p38α的变构疏水口袋及其他活性位点以外的新区域,并未作用于ATP的结合活性位点,故对于ATP与p38α激酶的结合无竞争性抑制作用,并且与P38α激酶的结合作用较弱,故推测络石苷元B 对P38α靶酶无抑制作用。而后续查阅相关文献发现,有多个药理实验研究证实[29-34],牛蒡子苷元和牛蒡子苷具有抗炎作用,即二者可抑制脂多糖LPS诱导下的巨噬细胞产生的多种炎症因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等）,药理实验结果与笔者的研究结论相一致,但二者发挥抗炎作用的靶酶及作用机制并未见文献报道。本研究从分子间相互作用的角度,阐释了二者抗炎药理作用的机制,牛蒡子苷元和牛蒡子苷与P38αMAPK 的活性位点存在较好的分子间结合作用,可竞争性阻碍该活性位点与ATP 的结合,能通过抑制P38αMAPK 而发挥减少炎症因子生成的抗炎作用,同时也为P38αMAPK 新型抑制剂的设计及进一步的分子结构改造提供了一定的参考价值。新颁布的药品法也再次强调了药品创新的重大意义,并且也指出中医药是现阶段创新研究的巨大资源宝库,故利用现代化技术手段,发掘中药药效物质基础成分,推动药物创新,这也正是当代科学研究人员应该做的工作。