盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的制备与质量评价

熊慧敏,陈安琪,于 华,张 琳*

1.北京联合大学特殊教育学院,北京 100075;2.泰投华信（北京）科技发展有限公司,北京 100018

盐酸小檗碱是从中药黄连中提取的一种季铵生物碱,其对溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌及弗氏和志贺氏痢疾杆菌等均有抗菌作用,已广泛用于治疗痢疾、眼结膜炎以及化脓性中耳炎等细菌性感染性疾病,疗效显著[1]。近年来临床研究表明,盐酸小檗碱对幽门螺杆菌引发的慢性胃炎具有一定的治疗效果[2]。小檗碱味苦,且普通口服片剂在胃排空作用下快速进入肠道中,在胃内滞留时间较短,影响药效发挥[3]。胃漂浮系统可延长药物在胃中的滞留时间,确保在胃中始终维持一定的药物浓度,增加局部治疗效果,减少毒性和不良反应[4]。因此,本研究将盐酸小檗碱制备成胃漂浮海藻酸钙微球,以延长药物在胃中的滞留时间,提高药物的安全性和有效性,实现胃靶向治疗目的[5-6]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Chromaster型高效液相色谱仪色谱管理系统（日立科学仪器有限公司）;08-2G 型恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）;SEM3000s型扫描电子显微镜（国仪量子合肥技术有限公司）;RCZ-8N 型智能药物溶出度仪（上海黄海药检仪器有限公司）;高精度不锈钢游标卡尺（日本三丰公司）。

1.2 试药

盐酸小檗碱（东北制药集团股份有限公司）;蓖麻油和氯化钙（CaCl2）,均购自湖北葛店人福药用辅料有限责任公司;壳聚糖（湖南新绿方药业有限公司）;海藻酸钠（青岛明月海藻集团有限公司）;盐酸（南京化学试剂股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的制备

经过前期预实验,本研究采用乳化-交联固化法制备盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球[7-8]。取处方量的盐酸小檗碱和海藻酸钠溶解到100 mL纯化水中,在高速（2 500 r·min-1）磁力搅拌下,将处方量橄榄油滴加到海藻酸钠水溶液中,持续搅拌10 min,形成初乳分散液,再将初乳分散液置于冰水浴中以200 W 功率超声处理10 min,形成稳定的乳液;另取处方量的CaCl2和壳聚糖加入到质量浓度为50 mg·mL-1的乙酸溶液中,持续搅拌10 min,分散均匀;在低速（500 r·min-1）磁力搅拌下,将上述乳液通过7号注射器针头滴加到乙酸溶液中,滴加结束后持续放置30 min,充分完成交联反应;用筛网过滤得到微球,用纯化水洗涤,并在40℃烘箱中干燥,得到盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球。

2.2 包封率测定

取一定量盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球置于研钵中研成细粉,精密称取500 mg粉末,置于50 mL量瓶中,再加入pH1.2盐酸溶液40 mL,水浴超声,定容。所得溶液经0.45μm 微孔滤膜过滤,取续滤液测定药物含量,计算包封率[9]。包封率（%）=实际载药量（W实）÷理论投药量（W投）×100%。

2.3 体外漂浮率测定

按照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版溶出度与释放度测定法中的转篮法评价盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的体外漂浮性[10]。取50个盐酸小檗碱海藻酸钙微球置于转篮中（pH 1.2的盐酸溶液、体积为500 mL、温度为37℃±0.5℃、转速为100 r·min-1）,12 h后目测漂浮在转篮顶部的微球数量,按照公式计算盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的漂浮率。漂浮率（%）=漂浮微球数÷微球总数×100%。

2.4 处方优化

2.4.1 橄榄油用量考察 盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球能产生漂浮性是由于处方中加入了橄榄油,其密度约为0.909 g·cm-3。预实验过程中发现橄榄油在处方中的用量会对盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的漂浮性及药物包封率产生一定的影响,因此本研究固定处方中海藻酸钠质量浓度为30 mg·mL-1,CaCl2质量浓度为5 mg·mL-1,壳聚糖质量浓度为5 mg·mL-1,凝胶化30 min,橄榄油用量见表1,按照表1用量依次制备盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球,考察橄榄油用量对药物包封率和漂浮率的影响。

表1 橄榄油用量对药物包封率和漂浮率的影响Tab.1 Influence of olive oil amount on encapsulation rate and floating rate

由表1可知,随着橄榄油用量的增加,盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的药物包封率呈降低趋势,这是由于盐酸小檗碱在水中的溶解度较高,在橄榄油中的溶解度较小,随着橄榄油用量的增加,微球中包裹的橄榄油增加,因此不利于药物包封;而盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的漂浮率与橄榄油的用量呈正相关,随着橄榄油用量的增加,微球中包裹的橄榄油增多,微球更易漂浮。最终确定微球处方中橄榄油用量占比为15%。

2.4.2 实验设计优化处方 固定橄榄油用量占比为15%,应用Box-Behnken实验设计考察海藻酸钠质量浓度（X1）、CaCl2质量浓度（X2）和壳聚糖质量浓度（X3）3个关键处方变量对盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球包封率（Y）的影响。实验设计中3个变量设置为低（+1）、中（0）和高（-1）3个水平,见表2。共进行了17次实验,实验结果见表3。

表2 Box-Behnken实验设计中独立变量与水平Tab.2 The independent variables and levels in Box-Behnken experiment design

表3 实验设计及结果Tab.3 Results of Box-Behnken experiment design

使用多元二次方程对实验数据进行方差分析,结果见表4。由表4可知,回归方程系数的显著性,模型P值小于0.05,说明所选模型显著;一次项（X1,X2,X3）和二次项（）的P值均小于0.05,说明3个处方变量对包封率影响均显著;失拟项P值大于0.05,说明该模型实测值与预测值之间不存在显著性差异,能够准确预测实验数据[11]。多元二次方程拟合方程为:Y=3.55+2.17X1+4.23X2+4.53X3+0.06X1X2-0.02X1X3+0.20X2X3-0.04（R2=0.998 1）。

表4 海藻酸钠质量浓度（X1）、CaCl2 质量浓度（X2）和壳聚糖质量浓度（X3）对包封率（Y）影响的方差分析结果Tab.4 The ANOVA results of the influence of sodium alginate concentration（X1）,CaCl2 concentration（X2）and chitosan concentration（X3）on the encapsulation efficiency（Y）

通过效应面图（见图1）可更直观地分析海藻酸钠质量浓度（X1）、CaCl2质量浓度（X2）和壳聚糖质量浓度（X3）对包封率（Y）的影响。由图1可知,随着海藻酸钠质量浓度、CaCl2质量浓度和壳聚糖质量浓度的增加,盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的包封率均出现先增加后降低的趋势。海藻酸钠和CaCl2的质量浓度对包封率的影响可作如下解释:当海藻酸钠和CaCl2质量浓度较低时,在凝胶化过程中药物可扩散出去,药物包封率较低,而随着海藻酸钠和CaCl2质量浓度的增加,体系黏度增大,阻碍了药物向外扩散,表现为包封率增大,但是随着海藻酸钠和CaCl2质量浓度的继续增加,体系黏度急剧增大,CaCl2很难扩散至海藻酸钠中发生交联反应,导致包封率降低[12]。壳聚糖质量浓度对包封率的影响可解释为:随着壳聚糖质量浓度的增加,壳聚糖的氨基（NH3+）基团与海藻酸钠中的羧基（COO-）基团通过静电作用相互交联,在微球表面形成聚合物复合膜,从而抑制了药物向外扩散,药物包封率增加,但是壳聚糖质量浓度继续增加,过量的壳聚糖会阻碍CaCl2和与海藻酸钠交联,导致包封率降低。

图1 海藻酸钠质量浓度（X1）、CaCl2 质量浓度（X2）和壳聚糖质量浓度（X3）对盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球包封率（Y）影响的响应面图Fig.1 Response surface plot of the influence of sodium alginate concentration （X1）,CaCl2 concentration（X2）and chitosan concentration（X3）on the encapsulation efficiency（Y）of calcium alginate microspheres

本研究要求制备的盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的包封率最大,通过Design-Expert 10.1软件预测获得微球的处方设计空间,在设计空间内任选一点（海藻酸钠质量浓度为33.0 mg·mL-1,CaCl2质量浓度为10.0 mg·mL-1,壳聚糖质量浓度为10.0 mg·mL-1）,经软件预测得到的盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的包封率为88.6%。按照该处方制备3批盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球,测定包封率为87.4%±1.2%,与预测值之间的误差为-1.37%,偏差较小,说明模型预测可靠性较高。

2.5 质量评价

2.5.1 粒径及密度测定 通过游标卡尺测定50个盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的直径,并精密称定其质量,计算平均密度。经测定微球的平均直径为（1.24±0.07）mm,计算得微球的密度为（0.93±0.05）g·cm-3,该值低于水的密度（1.00 g·cm-3）,可确保微球在体内能够漂浮。

2.5.2 微观形态观察 取盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球放在带有导电胶的铝板上,真空喷金;另取一粒微球,用钢刀切成两半,放在带有导电胶的铝板上,真空喷金。取上述2份样品在扫描电镜（加速电压为15 kV）下观察表面及内部结构,见图2。

图2 盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球（A）、微球表面（B）和微球内部（C）的扫描电镜照片Fig.2 The SEM photographs of the berberine hydrochloride gastric floating calcium alginate microspheres（A）,the surface of the microspheres （B）,and the cross section （C） of the microspheres

盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球照片显示其为圆整球形,大小均匀,质地坚硬,外观呈浅褐色半透明状（见图2A）;扫描电镜照片显示,其外表面较为粗糙（见图2B）,内部呈多孔状（见图2C）,这些结构是在凝胶化过程中产生的,橄榄油被包裹在这些小孔中产生了漂浮力[13]。

2.5.3 体外漂浮性研究 按照2.3项下体外漂浮率测定方法考察盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的体外漂浮性,并观察微球的外观。结果显示,微球在pH1.2盐酸溶液中会100%立即漂浮,且能持续漂浮12 h,实验结束时微球均保持其完整性,可推测微球进入体内会长时间漂浮在胃液中。

2.5.4 体外释放研究 采用《中国药典》2020年版溶出度与释放度测定法中的转篮法评价盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的体外释放度[14]。取市售小檗碱片和盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球（含有100 mg小檗碱）置于转篮中,释放介质为pH1.2盐酸溶液,体积为500 mL,水浴温度为37℃±0.5℃,转速为100 r·min-1,在预定的时间间隔取出5 mL释放介质（补加同温同体积空白介质）,经0.22μm 滤膜过滤,稀释至一定倍数,采用HPLC法检测药物含量,绘制药物累积溶出度-时间曲线。见图3。同时将释放数据采用不同释放动力学方程模型进行拟合,以研究药物释放动力学行为。

图3 市售盐酸小檗碱片和盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球在pH1.2盐酸溶液中的释放曲线 （n=6）Fig.3 The drug release curves of berberine hydrochloride tablets and calcium alginate microspheres in pH1.2 hydrochloric acid solution（n=6）

由图3可知,小檗碱片在1 h时药物完全溶出;盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球中药物显示出双相释药模式,前2 h药物释放量达到36.3%±2.1%,释放速率较快,这部分是吸附在微球表面的小檗碱被释放,而从2 h至12 h内微球则表现为持续缓慢释放药物,最终药物释放量达到88.1%±2.8%,这部分是包裹在微球内部的小檗碱被缓慢扩散。盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球的药物释放数据经零级、一级、Higuchi、Korsmeyer-Peppas方程拟合（结果见表5）,结果显示,盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球中药物释放符合Higuchi方程（相关系数R2越接近1说明拟合效果越好）,结果表明,盐酸小檗碱胃漂浮海藻酸钙微球中的药物释放为扩散机制[15]。

表5 不同释药模型拟合结果Tab.5 Fitting results of different release models

3 讨论

胃漂浮给药系统可分为一单元制剂和多单元制剂[16]。一单元制剂的主要代表是漂浮片,由于胃排空速率存在个体间差异,患者在服用漂浮片后药物在胃内的滞留时间存在不确定性;多单元制剂的主要代表是漂浮微球,它与漂浮片相比具有胃内分布均匀、可避免完全被胃排空、个体间差异小、胃内滞留时间长的优势。因此本研究将盐酸小檗碱制备成胃漂浮海藻酸钙微球。

海藻酸钙微球主要由海藻酸钠、CaCl2和壳聚糖构成,海藻酸钠是从海藻中提取的一种天然多糖高分子化合物,生物相容性良好,可生物降解,由于自身带有大量的羧基（COO-）基团,可与Ca2+发生凝胶化反应,形成多孔状海藻酸钙凝胶[17];壳聚糖是通过天然多糖甲壳素部分脱乙酰基而得到,生物相容性良好,其在酸性环境中带有大量的氨基（NH3+）基团,可与海藻酸钠形成聚合物复合膜[18],能够很好的改善微球表面形态,控制药物释放速率,减少药物突释。