陕西汉中不同产区泥附子中酯型生物碱类成分的测定

李 凡,田 浩,马 杰,田文博,王卫锋,李莎莎,张景霞,李 芳*

1.陕西省中医药研究院,西安 710003;2.陕西佛缘中药产业集团股份有限公司洋县分公司,洋县 723300;3.汉中市杰丰养殖专业合作社,汉中 723100;4.西安国际医学中心有限公司,西安 710119

附子为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根。6 月下旬至8 月上旬采挖,除去母根、须根及泥沙,习称“泥附子”。附子在临床上应用广泛,能够回阳救逆、补火助阳、散寒止痛,用于治疗亡阳虚脱、肢冷脉微、心阳不足、胸痹心痛、虚寒吐泻、皖腹冷痛、肾阳虚衰、阳痿宫冷、阴寒水肿、阳虚外感、寒湿痹痛,有“回阳救逆第一品”之称。2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）一部[1]对乌头碱、次乌头碱和新乌头碱3种双酯型生物碱进行限量检查,对苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱等单酯型生物碱进行含量测定,以保证药材的质量和安全性。陕西省汉中市是泥附子的原产区和主产区之一,种植历史悠久,产量大。产自汉中的泥附子于2009年获得国家地理标志产品保护。泥附子需经炮制后方可入药。由于泥附子不易保存,课题组实地采集了产自陕西汉中4个县（区）的15批泥附子样品,采用超高效液相色谱法（ultra performance liquid chromatography,UPLC）同时对样品中6种酯型生物碱的含量进行测定,为进一步的研究奠定基础。

3)将原有的药剂塑料管改为钢管，减弱草酸、TL-1和P86对管道的腐蚀作用，在配制TL-1的搅拌桶上加装盖板，防止蒸汽和粉尘对人体的危害。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Acquity H-CLASS 型超高效液相色谱仪（UPLC Empower TM3色谱工作站、PDA检测器）,ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm,1.7μm）,电子分析天平（型号BT25S,d=0.01 mg,BS210S,d=0.1 mg）,均购自北京赛多利斯天平有限公司;FOEA26810D型纯水机（德国Millipore公司）;KH-300DE型数控超声波清洗机（昆山禾创超声仪器有限公司）;电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）;RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药

6种对照品均购自克洛玛科技有限公司:苯甲酰新乌头原碱,批号CHB180310,质量分数≥98%;苯甲酰乌头原碱,批号CHB180309,质量分数≥98%;苯甲酰次乌头原碱,批号CHB180307,质量分数≥98%;乌头碱,批号CHB180408,质量分数≥98%;新乌头碱,批号CHB180311,质量分数≥98%;次乌头碱,批号CHB180524,质量分数≥98%。乙腈（HPLC级,美国TEDIA公司）;色谱用水为娃哈哈纯净水;其他试剂均为分析纯,均购自西安化学试剂厂。

泥附子样品由课题组于2020年6月下旬至8月上旬在陕西省汉中地区实地采集,经王卫锋主任药师鉴定为毛茛科植物乌头（Aconitumcarmichaelii Debx.）的子根,样品信息见表1。

表1 泥附子的样品信息Tab.1 Sample information of aconite

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密吸取混合对照品溶液（质量浓度分别为180.68、70.24、132.53、549.35、370.45、525.66 μg·mL-1）0.5、1、2、5、7.5、10mL分别置于6个10mL量瓶中,用异丙醇-二氯甲烷（1∶1）定容至刻度,摇匀,制成系列质量浓度的混合对照品溶液。按照2.3项下色谱条件测定,各进样1μL。以质量浓度（μg·mL-1）为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）,进行线性回归,绘制标准曲线,得线性回归方程。结果见表3。

表2 6种酯型生物碱混合对照品的质量浓度Tab.2 Concentration of the 6 kinds of ester-type alkaloids mixed reference substance

2.2 供试品溶液的制备

取S6样品,按照2.2项下的方法平行制备6份,并按2.3项下色谱条件测定,计算含量。结果①～⑥号酯型生物碱的平均含量分别为0.009 2%、0.003 7%、0.005 5%、0.025 4%、0.013 6%、0.070 4%,RSD 值分别为0.76%、0.93%、1.04%、0.93%、1.10%、0.94%,表明该方法的重复性良好。

2.3 色谱条件

取2.1项下混合对照品溶液,按2.3项下色谱条件连续进样6次,每次进样2μL,记录色谱峰面积,结果①～⑥号酯型生物碱对照品峰面积的RSD 值分别为0.81%、0.67%、0.77%、0.31%、0.45%、0.79%,表明仪器的精密度良好。

研究还发现，不同类型学校学生的艾滋病知晓率存在差异，中专/高职/高专高于大学生，反映出艾滋病的宣传教育在不同类型学校间实施的不均衡性［14］，覆盖不够全面。有研究显示，学历较高的学生由于更侧重于专业知识的研究，导致其艾滋病知识掌握情况不及学历较低的学生［15］。提示艾滋病宣传教育应全面覆盖不同类型学校、学历人群，不断提高学生的艾滋病防治知识水平。

图1 UPLC图Fig.1 UPLC chromatograms

2.4 线性关系考察

分别精密称取6种酯型生物碱对照品适量,加异丙醇-二氯甲烷（1∶1）制成混合溶液。6种对照品的质量浓度见表2。

表3 6种酯型生物碱的线性关系Tab.3 Linear relationship of the 6 ester-type alkaloids

2.5 精密度实验

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm,1.7μm）;流动相:乙腈为流动相A,0.04 mol·L-1乙酸铵溶液（氨水调pH=10）为流动相B;梯度洗脱:0～5 min,26%A→5～15 min,26%～39%A→15～20 min,39%～45%A→20～25 min,45%～39%A→25～30 min,39%～26%A;柱温:25℃;对照品进样量:2μL,供试品进样量:1μL;检测波长:235 nm。结果见图1。

2.6 重复性实验

将实地采集的泥附子样品洗净、切片后干燥,粉碎。精密称取各样品粉末（过3号筛）2 g,置于锥形瓶中,加入氨试液3 mL,精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL,称质量;超声处理（功率300 W,频率40 Hz,水温低于25℃）30 min,放冷,再称质量;用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液补足质量,摇匀,过滤;精密量取滤液25 mL,40℃以下减压回收溶剂至干,精密加入0.5 mL·L-1盐酸甲醇溶液3mL溶解残渣,过0.22μm滤膜,取滤液,即得供试液S1～S15。

谢烟客在《侠客行》中是一个十分有意思的人物，青袍短须，容貌清癯，而且还会弹指神通。他是个狂妄傲世、亦正亦邪的世外高人，行事风格不能以常理测度，纯是一厢情愿凭个人的喜好。武功、性格、脾气、行事，活脱脱就像是《射雕英雄传》中黄药师的翻版。可是，当我们细读原文的时候发现，谢烟客除了名字风格和黄药师比较像以外，其他许多地方实在是不值一提，和我们装逼界的大佬黄药师相比，可谓是有云泥之别。

与分站功能类似，主站功能主要包括查询统计功能、人机界面以及分析管理等功能。其中采集功能主要是利用子站的通信情况，对IED设备的自检、动作、正常运行以及相应的数据进行收集，查询功能主要是对日常设备运行情况的统计与检索。人机交互功能可以通过GIS等技术进行定位，确保全部定位可以在地图中完成。

2.7 稳定性实验

精密称取6份已知①～⑥号酯型生物碱含量的S6样品1.0 g,分别精密加入2.1项下混合对照品溶液2 mL,再按照2.2项下的方法制备供试品溶液,按2.3项下色谱条件进行测定,计算①～⑥号酯型生物碱的加样回收率,结果见表4。由表4可见,该方法的回收率较高。

2.8 回收率实验

取S6样品,按2.3项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12 h测定,结果①～⑥号酯型生物碱峰面积的RSD值分别 为1.10%、0.92%、0.79%、1.08%、0.77%、1.14%,表明样品在12 h内的稳定性良好。

表4 6种酯型生物碱回收率的实验结果Tab.4 Results of recovery rate of the 6 ester-type alkaloids

表4 （续） 6种酯型生物碱回收率的实验结果Tab.4 （Continued）Results of recovery rate of the 6 ester-type alkaloids

2.9 含量测定

取2.2 项下制备的S1～S15供试品溶液,按照2.3项下色谱条件进行测定,记录峰面积。采用外标法计算陕西省汉中市不同产区附子样品中6种酯型生物碱的含量。结果见表5。

3 讨论

本实验建立了同时测定泥附子中6种酯型生物碱含量的UPLC法。药材的质量主要是由其化学成分决定的,不同产地甚至同一产地不同个体间化学成分具有变异性。陕西省汉中地区地势复杂,地形特点为南低北高,汉中市内有平坝、丘陵和山地3种地貌,平坝海拔为500～600 m,地势平坦,土壤肥沃;丘陵海拔为601～800 m,地势起伏较大;山区是秦岭南坡形成的浅山和中山地区,地势较为复杂,海拔在701～2 038 m。由于不同经度、纬度海拔差距较大,故4个产区样品中所含的6种酯型生物碱的含量均有明显差异,体现了不同产地泥附子“同种异质”的客观性。下一步应在汉中泥附子地理标志产品保护范围内扩大样品的采集区域,并增加采集的数量,进行更深入的比较研究。

本研究在已有文献的基础上[2-21],不断优化色谱条件,最终将色谱条件确定为乙腈为流动相A,0.04 mol·L-1乙酸铵溶液（氨水调pH=10）为流动相B,0～5 min,26%A,5～15 min,26%～39%A,15～20 min,39%～45%A,20～25 min,45%～39%A,25～30 min,39%～26%A;柱温为25℃。

(3) 模具制造取得了一定的成功，但是由于新模块的加入，在模具防锈，机械元件润滑等尚有不足之处，需要不断完善，模具刃磨时需要增加防护措施。

4 结论

本研究采用UPLC法进行检测,灵敏度高,分离度好,检测速度快,大大减少了试剂用量。在该检测条件下,附子6种酯型生物碱各峰的分离度良好,操作简便、重复性好,为泥附子的进一步炮制以及生品与炮制品的比较研究提供了依据。