9 种中药单体对艰难梭菌的体外抑菌活性研究*

杨 景，陈向东，汪 辉，强俊磊，田宇航

中国药科大学 生命科学与技术学院微生物学教研室，南京 211198

艰难梭菌是一种专性厌氧、革兰阳性、梭状芽孢杆菌[1]。该菌主要通过毒素介导，导致分泌性腹泻，致使肠壁出现炎症、黏膜出血坏死，甚至形成假膜性炎症[2]。目前，临床上治疗艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）应用最广泛地是抗生素，普遍使用的是万古霉素（VAN）、非达霉素[3]以及替换药甲硝唑[4]。但随着抗生素的广泛应用，艰难梭菌耐药性逐渐增强，人体肠道菌群失调，导致CDI 的发病率及致死率不断增高，成为院内感染腹泻的主要原因[5]。因此寻找新的治疗方案尤为重要。

本研究对国内近20 年有关治疗胃肠道疾病的中药单体的文献报道进行调研，选取资源丰富、无副作用、溶解性较好、具有抑菌活性的9 种中药单体，探究其对艰难梭菌的体外抑菌活性，旨在为中药单体治疗CDI 提供依据。

1 材 料

1.1 菌株

50 株艰难梭菌临床分离株，由中国疾病预防控制中心提供。标准菌株：艰难梭菌（Clostridium difficile ATCC 43593），脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis ATCC 25285）由北京百欧博伟生物技术公司提供。

1.2 药品和试剂

黄芩素、槲皮素、姜黄素、大黄素、原花青素、黄芪多糖、二氢杨梅素（瑞迪生物公司）；没食子酸（科密欧化学试剂公司）；鞣花酸（圣青生物公司）；万古霉素、替硝唑（上海源叶生物公司）；CCFA 琼脂基础、脑心浸液肉汤、脑心浸液琼脂、布氏肉汤、布氏琼脂（青岛海博公司）；DMSO（国药集团化学试剂公司）。

1.3 仪器设备

厌氧培养箱（Thermo）；多点接种仪（日本佐久间SAKUMA）；洁净工作台（吴江净化设备总厂）；GHX-9080B 恒温培养箱（上海福玛实验设备公司）。

2 方 法

2.1 对艰难梭菌有抑菌活性的中药单体的初筛

采用滤纸片法测定9 种中药单体对艰难梭菌的抑菌活性。称取适量黄芩素、槲皮素、姜黄素、大黄素、鞣花酸溶解于含5% DMSO 的BHI 培养基中。将没食子酸、原花青素、二氢杨梅素、黄芪多糖溶解在BHI 中，配制成浓度为10 mg·mL-1的溶液。同时设置VAN 和溶剂对照组。将6 mm 无菌滤纸片浸入溶液中6～8 h，备用。

选取活化的艰难梭菌单菌落，接种于BHI 培养基，37℃厌氧培养24～48h，调整菌浓度为1×106CFU·mL-1。将含药滤纸片贴在涂布有艰难梭菌菌悬液的BHI 平板表面，37℃厌氧培养24～48h，测量抑菌圈。

2.2 最低抑菌浓度（MIC）测定

参照CLSI 推荐的《厌氧菌药物敏感性试验方法（M11-A7）》，以琼脂稀释法测定“2.1”中抑菌圈较大的中药单体，对50 株艰难梭菌临床分离株的MIC，以VAN、替硝唑为标准品。倍比稀释配制0.02～20mg·mL-1的中药单体溶液，取不同浓度的药液1.5 mL 与含有5%无菌脱纤维羊血的强化布氏琼脂培养基，立即混匀，倒入无菌培养皿中，制备含药平板，同时制备不含药液的空白平板。选取活化的艰难梭菌单菌落，配制成0.5 麦氏浊度的菌悬液，用多点接种仪将50 株艰难梭菌临床分离株和质控菌的菌悬液接种到含药平板上，37 ℃厌氧培养24～48 h，设置需氧对照，药敏结果的判读参照CLSI 的M11-A7。

2.3 最低杀菌浓度（MBC）测定

采用微量肉汤稀释法测定抑菌活性较好的中药单体对艰难梭菌的MBC。在96 孔板中进行微量稀释测定，先加入不同浓度的中药单体或VAN，然后加入菌悬液，使得中药单体的最终浓度为0.002～2 mg·mL-1，VAN 的终浓度为0.03125～32 μg·mL-1，菌悬液和含5% DMSO 的BHI 培养基作对照。37 ℃厌氧培养24～48 h，以肉眼可见澄清的药物的最低浓度为MIC。从未变浑浊的孔中吸取培养物加入培养皿内，再倒入已融化并冷却至45 ℃～50 ℃的BHI琼脂培养基，混合均匀，待冷凝后将培养皿翻转，于37 ℃厌氧培养24～48 h，以菌落数不超过5 个的平板所对应的孔的最低药物浓度即为MBC。

2.4 pH 稳定性测定

采用滤纸片法测定pH 对抑菌活性较好的中药单体抑菌活性的影响。将DMSO 与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液相混合，配成缓冲溶液，分别配制不同pH 值（3、4、5、6、7、8）、浓度为10 mg·mL-1的中药单体溶液，设置VAN 和溶剂对照组，将6 mm 无菌滤纸片浸入溶液中6～8 h，备用。将含药滤纸片贴在涂布有艰难梭菌菌悬液的BHI 平板表面，37 ℃厌氧培养24～48 h，测量抑菌圈。

2.5 中药单体与万古霉素联合抑菌实验

采用微量肉汤稀释法测定抑菌活性较好的中药单体与VAN 的联合抑菌作用。选取8×8 棋盘法混合制备抗菌药物混合液，VAN 的终浓度为0.0078～1μg·mL-1，中药单体的终浓度为0.01～2.5mg·mL-1，随后加入艰难梭菌菌悬液，37 ℃厌氧培养24～48 h。同时设置菌悬液和溶剂对照，每个浓度设置3组平行，联合用药结果用部分抑菌浓度指数（FIC index）判定。

3 结果

3.1 对艰难梭菌有抑菌活性的中药单体的初筛

滤纸片法结果显示，浓度为10mg·mL-1的9 种中药单体对艰难梭菌具有不同程度的抑制作用，其中黄芩素、槲皮素的抑菌圈较大，效果较好，见图1。它们的抑菌圈直径分别为（16.12±0.50）mm、（12.47±0.89）mm。

图1 黄芩素、槲皮素对艰难梭菌的抑菌效果（滤纸片法）

3.2 MIC 和MBC 测定

黄芩素、槲皮素对艰难梭菌的MIC 和MBC 测定结果见表1。两者的抑菌活性较好。

表1 黄芩素、槲皮素对艰难梭菌的MIC、MBC（mg·mL-1）

3.3 pH 稳定性测定

由图2 所示，pH 在3～8 变化对黄芩素、槲皮素的抑菌活性无明显影响，表明有良好的pH 稳定性。

图2 不同pH 对黄芩素、槲皮素抑菌活性的影响

3.4 两个中药单体与万古霉素联合抑菌实验

黄芩素、槲皮素与VAN 的联合抑菌结果见表2。FIC index≤0.5，即黄芩素、槲皮素与VAN 之间都有协同作用，在联合用药中，黄芩素、槲皮素的MIC 值分别为单独用药的1/8、1/64 倍。

表2 黄芩素、槲皮素与VAN 的联合抑菌结果（MIC 值，mg·mL-1）

4 讨论

许多中药都有抑菌杀菌的作用，其有效成分多为挥发油、黄酮类、有机酸、多糖类、蒽醌和生物碱等，上述化合物已经被证实对耐药菌具有一定的抑制作用[6]。中药对肠道疾病也有良好的治疗潜力，可以调节肠道菌群和胃肠代谢水平，恢复肠道正常功能，起到益生元的作用，这与其中发挥作用的一些中药单体成分密切相关，对这些中药单体进行研究，对CDI 的治疗具有很大的意义。研究表明，黄芩素、槲皮素等抗菌谱较广，对金黄色葡萄球菌[7]、沙门氏菌、大肠埃希菌[8]等有较强的抗菌作用，还可以恢复肠道菌群的平衡、治疗胃肠道炎症[9]。黄芩素对金黄色葡萄球、大肠埃希菌的MIC 值分别为12.8～25.6、12.8～64.0 mg·mL-1。2～6 mg·L-1的黄芩素与庆大霉素体外可以协同抗耐万古霉素的肠球菌。槲皮素对MRSA、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的MIC值分别为0.6 mg·mL-1、0.0061、0.0242 μmol·mL-1，对肠球菌体外增殖均表现为强烈的抑制作用。

本实验研究黄芩素等9 种中药单体对50 株艰难梭菌的体外抑菌活性，对筛选出的抑菌活性较好的黄芩素、槲皮素的MIC、MBC 进行测定，黄芩素、槲皮素的MIC 分别为1.25、2.5 mg·mL-1，MBC 分别为1.25、5 mg·mL-1；在pH 3～8 下，抑菌活性没有明显变化，具有pH 稳定性；两者与VAN 联合使用具有协同作用。因此，黄芩素、槲皮素对艰难梭菌有良好的体外抑菌活性，可以与VAN 联合应用提高抑菌效果。

黄芩、柴胡具有悠久的历史、安全性高，黄芩素、槲皮素是其主要的有效成分，今后对黄芩素、槲皮素体内抑菌活性及相关机制开展进一步研究，为治疗CDI 提供更真切的选择。