miR-135a-5p通过调控Bcl-2/Bax通路对青光眼视网膜神经节细胞凋亡的作用机制*

谢九冰，杨杉杉，陈喜月，岳向东

(河北省唐山市眼科医院青光眼科 063000)

青光眼是当今世界范围内的主要致盲性眼病之一，主要表现为视神经生理凹陷扩大、视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)进行性缺损，其中RGCs凋亡和视神经纤维丢失是青光眼致盲的病理基础[1-2]。研究认为，眼压升高是青光眼的主要致病因素，临床治疗以降眼压为主，青光眼致病原因复杂，除与高眼压有关外，单纯降眼压不能完全阻止青光眼病情发展。有研究认为RGCs凋亡与青光眼的发病有密切关系，研究影响青光眼发病过程中的RGCs凋亡特点成为新的方向[3]。RGCs凋亡受多种因素影响，已经证实与营养因子中断、血液供应异常、谷氨酸及一氧化氮增多、基因突变等因素有关[4]。研究表明微RNA(microRNA,miRNAs)对轴突生长具有较强的影响，miRNAs的表达在神经系统损伤后发生变化[5]。miR-135家族成员如miR-135a、miR-135b、miR-135s的表达在特定类型的细胞中通过不同方式影响细胞增殖、分化和形成。研究证实miR-135a和miR-135b在体内和体外均能刺激雄性和雌性小鼠轴突生长和皮质神经元迁移,而miR-135s对损伤后轴突再生具有一定影响[6]。玻璃体内应用miR-135s可通过抑制Krüppel样因子4(KLF4)促进成年小鼠视神经损伤后RGCs轴突再生，相反，miR-135s的缺失降低了RGCs轴突的再生[7-8]。miR-135a-5p被证明是转化生长因子-β受体Ⅰ(transforming growth factor-β Ⅰ,TGFBR1)/转化生长因子-β激活激酶1(TGF-β activated kinase-1,TAK1)通路的关键调节因子，乙醇诱导的miR-135a下调可能通过上调Siah1和激活p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/p53通路而致使神经嵴细胞(NCCs)凋亡[9]。但miR-135a-5p对青光眼RGCs是否也有影响还尚不清楚。本研究将重点探究miR-135a-5p对青光眼RGCs凋亡的影响机制，希望为治疗青光眼提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂与仪器

BALB/C雄性小鼠购自北京永欣康泰科技发展有限公司，实验用RGCs购自上海斯信生物科技有限公司，DMEM培养基、胎牛血清购自北京天恩泽生物技术有限公司；重组腺病毒miR-135a-5p模拟物、重组腺病毒 miR-135a-5p抑制物、重组腺病毒空白载体购自上海博邦医药科技有限公司；LipofectamineTM2000、miRNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测试剂盒及兔抗鼠Bcl-2、Bax蛋白多克隆抗体、Cy3标记的羊抗兔IgG二抗购自北京百奥莱博科技有限公司，CCK-8细胞计数及细胞凋亡相关试剂盒购自上海碧云天生物公司，流式细胞仪和基因扩增仪购自美国Beckman公司。

1.2 青光眼RGCs模型建立

选取60只小鼠，将小鼠随机分为对照组20只、模型1组20只、模型2组20只。对照组小鼠不做任何处理，模型1、2组小鼠采用532 nm氩激光光凝小鼠小梁网组织建立小鼠青光眼模型[7]：采用5 mg/kg甲苯噻嗪混合液和80 mg/kg盐酸氯胺酮行腹腔内注射麻醉小鼠，用质量分数0.4%盐酸奥布卡因滴眼液点眼进行局部麻醉，532 nm氩激光击射小鼠角膜缘周围的小梁网组织，光斑为60～100个，直径50 mm，激光能量为300 mW，发射时间0.5 s,分别于术前，术后7、14 d使用TonoLab回弹式眼压计测量眼压，分别于造模第7天处死模型1组，造模第14天时处死模型2组及对照组小鼠获取视网膜标本用于检测RGCs凋亡率和miR-135a-5p表达水平。模型1、2组共成功建立青光眼RGCs模型小鼠36只，每组18只。

1.3 荧光金逆行标记检测模型鼠视网膜中RGCs数量

造模前4 d行 RGCs荧光金逆行标记，小鼠麻醉后固定于立体定位仪，沿颅顶正中线切开皮肤，以后囟中心为原点前移2 mm并旁开1.2 mm，用电钻凿直径约1 mm的骨孔，孔内缓慢注入2% 荧光金，止血，缝合皮肤。取于造模第14天处死的对照组和模型2组小鼠，取出眼球并置于质量分数4×多聚甲醛中固定1.5 h，于生理盐水中剥离视网膜，以视盘为中心行十字状剪开，将内层朝向盖玻片平铺视网膜，抗淬灭剂封片。用激光扫描共聚焦显微镜采集全视网膜图像，采用Image J软件分别计数距视盘1～2、>2～3和>3～4 mm处荧光金标记的RGCs。计算每平方毫米面积内RGCs数量。

1.4 RT-qPCR检测小鼠视网膜miR-135a-5p表达水平

提取建模小鼠视网膜细胞总RNA，经反转录获得cDNA。所有样品均重复测定3 次。引物序列miR-135a-5p正向5′-GGC AGC AAA GTT CTG AGA CAC-3′，反向5′-GTG CAG GGT CCG AGG TAT TC-3′；U6正向5′-CTC GCG CAG CCT TGA CA-3′;反向5′-AAC TTC GGA ATT GCA CTC GT-3′。取模板cDNA 2 μL进行RT-qPCR反应，反应条件：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40个循环。以U6为内参，采用2-△△Ct法计算miR-135a-5p表达水平。

1.5 细胞转染及分组

复苏RGCs，于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基[培养基添加青、链霉素和非必需氨基酸(1∶1 000)混合液]进行培养。将细胞分为3组，miR-135a-5p组转染miR-135a-5p mimic(序列为5′-UAU GGC UUU UUA UUC CUA UGU GA-3′)，空白组转染无意义序列miRNA-NC(序列为5-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′)，miR-135a-5p抑制组转染si-miR-135a-5p(序列为5′-GGU UGG UAG ACA UGU UAA AdTdT-3′)，按照Lipofectamin2000转染说明书进行转染。

1.6 流式细胞术检测细胞周期及凋亡

取各组细胞，胰蛋白酶消化收集细胞，离心，弃上清液，重悬细胞，加入2～3 mL预冷的70%冰乙醇，吹打均匀，置4 ℃冰箱中固定48 h，经1 000 r/min离心5 min弃乙醇，重悬后加入碘化丙啶(PI，100 mg/L)染液，在室温条件下避光混合30 min，采用流式细胞仪(美国Beckman公司)，激发光源为15 mW氩离子激发器，激发波长488 nm，应用Expo3.2 ADC分析软件进行数据分析，利用Muticycle AV软件对细胞周期及凋亡进行分析。

1.7 CCK-8检测RGCs活性

取各组细胞，并增设1个不含细胞的空白组和有细胞但不转染对照组，每组设3个平行组，以1.5×103/孔细胞浓度接种细胞至96孔板，进行细胞转染并培养24 h，加入10 μL CCK-8培养液，培养2 h后，用酶标仪测定各孔波长450 nm处的吸光(A)值，计算细胞活性， 各转染组细胞活性=[转染组A值-空白组A值]/[对照组A值-空白组A值]×100%。

1.8 Western blot 测定RGCs中Bcl-2、Bax蛋白表达水平

冰上加RPMI裂解液裂解各组细胞，取上清液，经BCA法测定蛋白浓度，取30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,转膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加入兔抗鼠Bcl-2、Bax、GAPDH蛋白一抗(1∶2 000)，GAPDH为参照，4 ℃孵育过夜。加入羊抗兔二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h。加入ECL发光液，凝胶成像系统检测蛋白条带，Image J软件分析蛋白条带灰度。

1.9 EdU检测miR-135a-5p对RGCs增殖的影响

取各组细胞接种至12孔板，5×104/孔，48 h后更换10 μmol/L Edu培养基(上海碧云天生物技术有限公司)，孵育2 h，4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染，去除培养基，PBS清洗。严格按照产品说明书进行实验步骤操作后，荧光显微镜拍照，Edu阳性细胞为红色代表增殖细胞数， DAPI阳性细胞为蓝色代表细胞总数，细胞增值率=Edu阳性细胞数/DAPI阳性细胞数×100%。

1.10 双荧光素酶报告实验检测miR-135a-5p与Bcl-2、Bax的相互作用关系

在http://www.targetscan.org/vert_72/网站对miR-135a-5p的靶基因进行预测，筛选出Bcl-2的3′ 非编码区(3′ UTR)与miR-135a-5p存在连续互补核苷酸序列。构建Bcl-2-3′ UTR野生型(WT)质粒、Bcl-2-3′ UTR突变型(MUT)质粒。将Bcl-2-3′ UTR的WT、MUT质粒与miR-NC、miR-135a-5p mimics共转染入RGCs，分为WT+miR-NC组、WT+miR-135a-5p mimics组、MUT+miR-NC组、MUT+miR-135a-5p mimics组，继续培养24 h收集细胞。按双荧光素酶活性检测试剂盒说明书步骤检测荧光素酶活性。相同方法检测Bax。

1.11 统计学处理

2 结 果

2.1 miR-135a-5p在青光眼小鼠模型RGCs中的表达变化

采用氩激光光凝小梁网建立青光眼小鼠模型，随着模型处理时间增加，miR-135a-5p表达逐渐降低，RGCs活细胞数量减少。对照组、模型1组、模型2组间miR-135a-5p、RGCs活细胞数量比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 miR-135a-5p在小鼠青光眼视网膜RGCs中的表达

2.2 各组RGCs miR-135a-5p的表达水平变化及其对RGCs活性的影响

PCR结果表明，miR-135a-5p组中miR-135a-5p高于空白组，而空白组高于miR-135a-5p抑制剂组(P<0.05)。CCK-8实验结果表明miR-135a-5p组RGCs活性高于空白组，空白组高于miR-135a-5p抑制剂组(P<0.05)。见表2。

表2 miR-135a-5p对RGCs活性的影响

2.3 miR-135a-5p对RGCs凋亡率的影响

流式细胞术结果表明，与空白组[(24.647±5.924)%]比较，miR-135a-5p组[(11.244±3.537)%]细胞凋亡率降低(F=67.251，P<0.05)，miR-135a-5p抑制剂组[(31.752±8.068)%]细胞凋亡率增加(F=60.460，P<0.05)，见图1。

2.4 miR-135a-5p对RGCs增殖的影响

EdU实验结果表明，与空白组比较，miR-135a-5p组细胞增殖显著增加，miR-135a-5p抑制剂组显著降低(P<0.05)，见图2。

图1 各组RGCs凋亡分析

A：EdU显微荧光图(100×)；B：EdU实验统计分析图；a:P<0.05,与空白组比较。

2.5 miR-135a-5p对RGCs 中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

Western blot结果显示，miR-135a-5p组RGCs中Bcl-2蛋白表达水平高于空白组，空白组高于miR-135a-5p抑制剂组(P<0.05)；miR-135a-5p组Bax蛋白表达水平低于空白组，空白组低于miR-135a-5p抑制剂组(P<0.05)；miR-135a-5p组Bcl-2/Bax值高于空白组，空白组高于miR-135a-5p抑制剂组(P<0.05)。见图3、表3。Pearson相关性分析显示，miR-135a-5p表达水平与Bcl-2呈正相关(r=0.523，P=0.000)，与Bax呈负相关(r=-0.632，P<0.001)。

表3 各组RGCs 中Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较

图3 RGCs 中Bcl-2、Bax蛋白表达

2.6 miR-135a-5p靶向调控Bcl-2/Bax表达

Targetscan预测显示，Bcl-2、Bax的3′ UTR部分碱基与miR-135a-5p存在连续互补配对序列。双荧光素酶报告实验结果显示， Bcl-2、Bax对应的MUT+miR-135a-5p mimics组与MUT+miR-NC组荧光素酶活性差异无统计学意义， WT+miR-135a-5p mimics组较WT+miR-NC组荧光素酶活性显著降低，见图4。

A：Bcl-2碱基互补配对序列和双荧光素酶检测报告；B：碱基互补配对序列和双荧光素酶检测分析报告；a:P<0.05,与miR-NC组比较。

3 讨 论

青光眼的共同特征是视神经的进行性退化，形态学特征可检测到RGCs丧失，小梁网结构损伤，视网膜神经纤维层变薄等[10]。青光眼致病可能与免疫反应相关的多个基因或途径的变化相关，以及视神经乳头(ONH)的结构和炎症变化有关。而大量证据表明，在人类和实验性青光眼模型中，RGCs凋亡是最终的共同途径[11]，当前对于视网膜神经保护的研究集中在阻止RGCs凋亡的思路上，如以神经保护治疗为目的的基因治疗，即通过转染腺病毒载体引入DNA分子转移至视网膜RGCs内，抑制其凋亡[12]。因此寻找可以影响RGCs凋亡的靶基因是探索治疗青光眼方法的重要研究方向。

miRNA涉及所有的生物进程，可以通过其表达变化，参与调控个体发育和细胞凋亡、增殖等活动[13]。研究显示，人眼中miRNA在神经视网膜、神经膜色素上皮和脉络膜中表现出高度选择性，发挥独特功能。在常见眼部疾病如糖尿病视网膜病变、视网膜色素变性、青光眼中均有相关报道表明miRNA参与其中[14]。研究发现，miRNA在眼压波动、小梁网结构重塑、促进神经再生等青光眼发病和治疗过程中有重要的调控作用，如miR-29b可负向调节小梁网细胞的外基质合成，miRNA-200c在青光眼眼压调节中发挥作用，可降低眼压[15]。视网膜中miR-135水平的降低进一步降低了RGCs轴突的再生。在神经元细胞中miR-135b和miR-135a可发挥轴突生长和神经元迁移促进因子的作用[16]。此外，玻璃体内应用miR-135s有助于成年小鼠视神经损伤后RGCs轴突的再生[17]。本研究中采用氩激光光凝小梁网建立小鼠青光眼模型，随着处理作用时间增加，miR-135a-5p表达水平逐渐降低，14 d时miR-135a-5p表达水平最低，提示miR-135a-5p在青光眼RGCs中呈低表达，动物模型结果显示在处理后的RGCs中miR-135a-5p表达水平及RGCs凋亡率均随着模型建立时间的延长而降低，说明青光眼可造成miR-135a-5p表达降低，RGCs凋亡增加，而已有研究表明RGCs凋亡是青光眼的病理特征之一，并证实青光眼患者RGCs凋亡是增加的[18]，这与以往研究结果一致。

RGCs凋亡是引起大部分视觉神经损伤的主要原因，因此研究青光眼环境对RGCs凋亡的影响很有意义[19]。 miRNAs可参与青光眼的发病过程，多种miRNA如miR-29b、miRNA-200c已经被证实参与调控青光眼的发生发展[20]。miR-135b和miR-135a可通过抑制锌指样核转录因子4(KLF4)促进轴突生长，来刺激中枢神经系统损伤后轴突的再生，KLF4是miR-135a和miR-135b在神经元中的靶点[21]。另外KLF4还具有调节神经元的固有轴突生长能力，视神经挤压实验表明，KLF4的下调和JAK-STAT3信号的激活可显著诱导中枢神经系统环境中再生轴突的生长[22]。本研究体外细胞实验显示RGCs内miR-135a-5p表达水平明显降低，同时RGCs凋亡率增加，可以推测miR-135a-5p可能参与了RGCs凋亡的调节。当miR-135a-5p表达水平被抑制后，RGCs的细胞活性明显降低，增加miR-135a-5p表达水平后RGCs的细胞活性增加，提示miR-135a-5p可能在RGCs的生长过程中发挥了重要作用，通过对RGCs凋亡率和增殖的进一步研究显示，miR-135a-5p抑制剂组在抑制miR-135a-5p后RGCs凋亡率较空白组增加，而在增加miR-135a-5p表达水平后RGCs凋亡率较空白组减少，同时通过EdU实验检测发现，miR-135a-5p表达水平上调后， RGCs增殖显著增加，miR-135a-5p表达水平下调后，RGCs增殖显著降低，说明miR-135a-5p在RGCs的凋亡中发挥抑制作用，并能促进细胞增殖。

青光眼中RGCs死亡机制尚不明确，但已经有较多研究证实是通过细胞凋亡途径实现的[23]。大量研究证实凋亡相关基因Bcl-2可抑制细胞凋亡。线粒体Bax是促凋亡基因，是细胞凋亡过程的关键节点处的单通道，是不同凋亡过程不可绕过的共有环节[24-25]。也有研究发现正常情况下，Bcl-2与Bax比值处于动态平衡，当Bcl-2表达高于Bax表达时，细胞趋向存活，反之则趋向凋亡[26]。本研究中双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-135a-5p可靶向调控Bcl-2、Bax表达，抑制miR-135a-5p后RGCs中Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平增加，而Bcl-2/Bax降低，但上调miR-135a-5p表达后，Bcl-2、Bax蛋白具有相反的表达情况，说明miR-135a-5p可影响RGCs内Bcl-2、Bax蛋白的表达水平，进而对RGCs凋亡产生影响。提示miR-135a-5p可能通过调控Bcl-2/Bax影响RGCs的凋亡。

综上，miR-135a-5p在RGCs中表达降低，miR-135a-5p高表达能降低RGCs的凋亡，其机制可能是通过调节Bcl-2、Bax来实现的。因此，可通过调控miR-135a-5p表达实现调控青光眼RGCs的凋亡。这为青光眼的预防、治疗及预后分析提供理论基础。但本研究也有一定不足，本研究并未针对其机制和调控通路做深入研究，本课题组将在后续工作中继续探究。