创伤性膝骨关节炎模型兔软骨下骨的影像学结构改变

张文凯，党晓谦

(1.西安交通大学第二附属医院骨一科 710004；2.陕西省咸阳市中心医院骨三科 712099)

随着社会不断的发展和人口老龄化的逐步加重，骨关节炎(osteoarthrtis,OA)的发病率也在逐年增加，据不完全统计中国OA的总患病率约为15%，因此相关学者也越来越重视OA的相关研究[1-5]。创伤性OA以外伤引起关节结构的改变为特点，尽管创伤性OA可从各种事故或受伤中发展而来，但普遍见于前交叉韧带(ACL)和半月板撕裂的运动损伤[6-10]。RADIN等[11]发现OA的软骨退行性改变和进展中，软骨下骨也发挥着某种作用，认为软骨下骨骨量和厚度的变化改变了其生物力学特性，由此引起或加重软骨结构的改变。软骨下骨改变是OA的重要因素，这种改变可促使软骨退变，但软骨下骨的这些改变是否为OA形成的启动因素至今尚未证实。因此，本研究拟通过动物模型观察创伤性膝OA和闭合损伤性膝OA中软骨下骨的结构改变，探讨软骨下骨的改变是OA疾病的原因还是结果，是疾病适应环境的改变还是疾病本身的病理过程，以期能更好地指导临床研究和治疗。

1 材料与方法

1.1 实验动物

36只10月龄清洁级巨型花明兔(雌雄各半)，体重(2 500±500)g。所有动物均由西安交通大学医学部动物实验中心提供，检疫均符合实验标准，生产许可证号：SCXK(陕)2017-004。

1.2 主要试剂与仪器

戊巴比妥钠注射粉剂(上海试剂二厂)；盐酸利多卡因注射液(上海朝晖药业有限公司)；普通石膏(厦门鹭燕医疗器械有限公司)；DR数字化X射线光片机器(南京利昂医疗设备制造有限公司)；西门子3.0T超导型磁共振成像(MRI)系统(德国Siemens公司)；Explore Locus SP型Micro-CT(美国GE公司)。

1.3 分组及造模

采用抽签方法将36只巨型花明兔随机分为3组：空白组、创伤组、闭合损伤组，每组12只。除空白组不做任何处理进行常规饲养外，其余各组按相应造模方法进行造模。创伤性膝OA模型：取12只巨型花明兔称重，耳缘静脉周围区域进行备皮，消毒，注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行全身麻醉，麻醉满意后将兔置于兔架上采用俯卧位固定四肢及头部，双侧后腿膝关节备皮、消毒、铺无菌巾，术区皮下注射2%利多卡因5 mL进行辅助麻醉。定位膝关节间隙，以膝关节间隙为中心稍偏内侧做一长约4 cm纵行切口，从皮下到关节囊逐层切开，避免损伤膝关节周围神经及血管，显露内侧半月板，用尖刀予以摘除，再找到前交叉韧带予以横断。再次行前抽屉试验确认前交叉韧带失效(注意动作轻巧，避免破坏关节软骨面)后用0.9%氯化钠溶液反复冲洗术野，彻底止血后逐层缝合切口，无菌纱布包扎伤口。采用相同的方法对对侧膝关节进行造模。术毕于臀部肌肉注射头孢唑啉钠预防感染，麻醉苏醒后将兔放归饲养笼内(1兔1笼)，笼上贴上标有该兔基本信息的标签，定期观察术区，如有异常及时处理。闭合性损伤膝OA模型：取12只巨型花明兔称重后按上述方法麻醉及固定，双后肢伸直位，从踝上2 cm处到髋关节下4 cm缠绕2层棉纸，将高分子石膏用凉水浸泡后，内层抹平，呈叠瓦状缠绕于棉纸上，缠绕6层，边缠绕边抹平边浇少量凉水在石膏上，然后在石膏外侧贴附小铝板1块(与石膏等长)加强石膏的固定作用，接着再用石膏缠绕6层包裹铝板。石膏塑形成功且麻醉苏醒后把兔放归饲养笼内(1兔1笼)，同时定期观察兔的基本状况和石膏的固定情况，若有石膏脱落或石膏位置不佳时及时修复处理，并做好记录。

1.4 检查及标本取材

1.4.1X线片和MRI检查

在造模后12周，将所有动物送往西安交通大学医学院附属西安市红十字会医院放射科和核磁共振室进行双侧后肢膝关节的正侧位X线片检查和双侧后肢膝关节冠状位及矢状位MRI扫描，采集相应图像并进行对比分析。

1.4.2Micro-CT检查

完成X线片和MRI检查后，于耳缘静脉快速推注空气约40 mL，空气栓塞法处死兔，触摸其心脏确认无脉搏后立即解剖双侧后肢膝关节，暴露膝关节腔，剥离软组织，用锯片截取完整的股骨髁和胫骨平台(厚度约为1.0～1.5 cm)，将标本置于专用Micro-CT扫描仪的标本杯中并用4%多聚甲醛固定，固定24 h后送至空军军医大学西京医院全军骨科研究所进行Micro-CT扫描。Micro-CT扫描参数：扫描分辨率14 μm，旋转角度360°，旋转角度增量0.4°，电压80 kV，电流80 μA，曝光时间2 960 ms，帕平均数4，像素组合1×1。图像参数：图像原始尺寸16.897 mm×13.442 mm×6.474 mm，图像分辨率29 μm，图像位数16位。扫描完成后导出图像数据并用Reconstructiong Utility软件对数据进行图像重建，保存图像，导入MicroView软件，选取感兴趣区域(region of interest,ROI)进行三维重建和观察，同时截取静态三维图像，应用高级骨形态分析(Advanced Bone Analysis)软件对ROI进行骨显微参数测试和分析。ROI软骨下骨骨小梁分析参数：骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb·Th)，即骨小梁的平均厚度；骨体积分数(bone volume fraction,BVF)，即骨小梁的体积除以标本的体积；骨小梁数量(trebecular number,Tb·n)，即骨组织与非骨组织的交点数量；骨小梁间隙(trabecular spacing,Tb·Sp)，即骨小梁之间的髓腔平均宽度；组织骨密度(tissue bone mineral density,tBMD)，即当前ROI内部被阈值二值化认定为骨骼部分的骨密度，不包括非骨骼部分的体素；体积骨密度(volumetric BMD,vBMD)，即为多孔骨小梁结构的表现密度，反映ROI内的总体骨矿盐密度。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 X线片检查结果

X线片检查结果显示空白组膝关节软骨下骨无明显改变；创伤组膝关节周围有大量骨赘形成，关节软骨下有明显的高密度影，关节内侧与外侧间隙不对等，内侧间隙明显小于外侧，关节面毛躁不平，呈明显OA改变；闭合损伤组膝关节周围可见少量骨赘形成，关节软骨下有稍高密度影，且范围局限，关节间隙稍有狭窄，关节面毛躁表现较轻。见图1。

2.2 MRI扫描结果

MRI扫描结果显示空白组膝关节软骨下骨无明显病理改变；创伤组膝关节MRI扫描可见大部分软骨缺失，深达骨质全层，可见软骨下骨骨质异常，残留软骨信号强度降低，其软骨下骨为高信号影；闭合损伤组膝关节MRI扫描显示关节软骨呈低信号影，软骨表面欠规整，局部有凹陷，关节软骨损伤达到软骨下骨。见图2。

A:空白组；B:创伤组；C:闭合损伤组。

2.3 Micro-CT检查结果

2.3.1Micro-CT三维重建

空白组膝关节软骨下骨无明显骨赘形成，软骨下骨骨小梁排列整齐有序，未见明显断裂；创伤组膝关节边缘可见大量骨赘形成，软骨下骨骨小梁稀疏断裂、扭曲；闭合损伤组膝关节周围骨赘形成较少，软骨下骨骨小梁少量断裂。见图3。

2.3.2软骨下骨显微结构参数

空白组软骨下骨显微结构变化不大；创伤组和闭合损伤组与空白组比较，股骨远端内侧、胫骨近端内侧软骨下骨显微参数变化显著，BVF、Tb·Th和Tb·n均明显降低，Tb·Sp、tBMD、vBMD明显增高，且创伤组改变更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 股骨远端内侧软骨下骨骨微结构显微参数

A:空白组；B:创伤组；C:闭合损伤组。

A:空白组；B:创伤组；C:闭合损伤组。

表2 胫骨近端内侧软骨下骨骨微结构显微参数

3 讨 论

OA是以关节内的软骨退变，周围骨赘形成为特点的一类骨关节疾病[12-16]。早期的OA患者有轻微的疼痛或无明显症状，而中晚期患者的疼痛明显加剧，甚至伴有活动受限，严重影响患者的生活质量[17-20]。OA根据其致病原因大致分为原发性OA和继发性OA；前者病因尚不明确，可能与年龄、肥胖、性别、长期负重、屈膝工作等有关；而继发性OA多见于创伤，也称创伤性OA，常见于扭伤致韧带或半月板损伤、关节内骨折、各种原因所致的关节内感染等[21-23]。虽然诸多研究使OA的概念、致病原因、病理病机、危险因子、临床治疗手段都在持续的革新和进步，但至今对其致病原因和病理生理机制仍未达成共识[24-26]。不可否认的是这些研究对OA的基础与临床研究进行了开拓，同时对临床治疗也有很大帮助，但至今仍无法找到药物或者措施来根治OA，此外对于OA的早期诊断和预防其恶化的方法目前也是十分有限。因此，探索OA发生发展过程中软骨下骨的结构特点，将有助于揭开OA的神秘面纱，为其预防、早期诊断、改善治疗开拓新的思路和方法。

有研究表明软骨下骨的病变可在软骨退行性改变之前，可直接驱使OA的形成或加速OA的发生与发展以致形成OA[27-29]。王永成等[30]认为在骨软骨缺损的自然发展历程和修复治疗中应当重视软骨下骨的临床重要性，需要更长时间观察和评价其机械生物力学性能。软骨下骨的骨重建过程不是一个简单的继发性事件，应该是与软骨发生的退行性改变紧密关联，在OA的驱使和进展过程中，钙化层骨化中心的再次活跃和软骨下骨骨转换率的增强发挥着重要的作用，软骨和软骨下骨以钙化层为媒介，相互作用，导致恶性循环[31]。本研究采用了创伤性膝OA和闭合损伤性膝OA兔模型，观察OA中软骨下骨在X线片、MRI、Micro-CT中的改变，通过模型间的横向对比，可以探究创伤和闭合损伤对于OA的形成和发展的影响。研究结果表明不管是创伤还是闭合损伤形成的OA中，均有软骨下骨形态结构的改变，且创伤造成的病变较闭合损伤更为严重，这不仅体现在宏观的X线片和MRI上，还体现在相对微观的Micro-CT显微参数中；在Micro-CT中，创伤性膝OA模型中膝关节软骨下骨骨小梁结构变化最明显，BVF、Tb·Th、Tb·n较正常和闭合损伤性OA模型均明显降低，而Tb·Sp、tBMD、vBMD明显增高。因此，软骨下骨的结构改变对于OA的治疗有着重要意义。