2020 年黑河市某规模化牛场BAstV 检测及ORF1a 基因遗传变异分析

杨硕 ，朱庆贺 ，王笑冉 ，孙东波

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；2.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院）

牛星状病毒（Bovine Astrovirus，BAstV）属于星状病毒科（Astroviridae，AstV），哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus）[1]，是一种小的、无包膜的病毒，粒子直径约为28~30 nm，具有独特的五尖或六尖星状病毒粒子结构，基因组由6.3~7.9 kb 的正链单股RNA组成，包括三个开放阅读框架（ORFs），即ORF1a、ORF1b、ORF2[2]。BAstV 属于星状病毒科，哺乳动物星状病毒属。1978 年，首次在英国患有肠炎的犊牛排泄物中发现该病毒[1]，但用分离的星状病毒样本感染无菌犊牛未引起腹泻，被认为是无致病性的病毒[3]。研究显示，1984 年美国分离的牛星状病毒US1 和US2毒株感染牛后会引起牛回肠上皮细胞感染和细胞病理学改变，粪便颜色由棕色变成黄色[4]，与英国的分离毒株UK 也存在抗原性关系。Woode GN 等[3]对UK、US1 和US2 三株星状病毒分离株的研究表明，它们的血清型不同，这意味着自然界中存在多种牛星状病毒血清型。BAstV 与轮状病毒、诺如病毒等病毒共同感染时，能够加重病牛的临床症状，但这是否具有临床相关性，或者该病毒在牛的腹泻发展过程中是否起协同作用，还需要进一步证实。近几年，一些报道显示BAstV 可能与牛神经系统疾病和脑脊髓炎相关联[5-7]，导致人们对研究BAstV 分子流行病学和致病性的兴趣增加。目前尚不清楚AstV 在呼吸道疾病中的作用，但越来越多的证据表明在患有急性呼吸道疾病的人和动物呼吸道样本中检测到AstV[8-11]。

目前，关于BAstV 在我国的流行情况和遗传进化等相关研究正在逐步完善。黑龙江地区尚没有关于牛星状病毒的病原流行情况的相关报道，使得黑龙江地区牛星状病毒具体感染情况、病毒的分子特征、变异及遗传进化情况不清晰，给犊牛腹泻的防控造成极大困难。因此，深入分析BAstV 的感染流行情况及遗传变异情况对星状病毒防控具有重要意义。研究通过RT-PCR 方法，对黑龙江地区黑河市某规模化牛场犊牛腹泻样品进行BAstV 病原检测，以及对BAstV ORF1a 基因遗传变异情况进行分析，旨为该病毒的有效防控提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

采集黑龙江省黑河市某规模化奶牛养殖场的腹泻犊牛粪便样品，共15 份，放置于-80 ℃冰箱内备用。

1.1.2 仪器设备

主要仪器设备见表1。

表1 仪器设备Table 1 The detail information of machines

1.1.3 主要试剂

主要试剂见表2。

表2 主要试剂Table 2 The detail information of reagents

1.1.4 引物设计

根据师志海等[14]建立的星状病毒PCR 检测方法，引用其引物序列，提交至生工生物工程（哈尔滨）股份有限公司成并使用。引物具体信息见表3。

表3 BAstV ORF1a 基因扩增引物Table 3 Primers for the amplification of BAstV ORF1a genes

1.2 方法

1.2.1 样品处理及病毒RNA 的提取

用3 倍体积的无菌PBS（PH=7.4）充分涡旋振荡5 min 制成匀浆，4 ℃ 8 000×g 离心 15 min，取上清，按照TIANGEN 病毒RNA 提取试剂盒的说明书提取RNA。

1.2.2 cDNA 合成

按照反转录试剂盒说明书完成反转录，具体操作如下：根据反转录体系加入相应反转录试剂，其中反转录体系见表4；轻轻混匀，简短离心；25 ℃孵育5 min；42 ℃孵育 30 min；70 ℃孵育 5 min 终止。

表4 反转录体系Table 4 Reverse transcription system

1.2.3 PCR 扩增及鉴定

以cDNA 为模板用表3 引物进行BAstV ORF1a基因的扩增。其中PCR 反应体系见表5，反应条件见表6。PCR 扩增产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

表5 PCR 反应体系Table 5 PCR reaction system

表6 PCR 反应条件Table 6 PCR reaction condition

1.2.4 ORF1a 基因克隆与测序

参照胶回收纯化试剂盒说明书，回收并纯化鉴定为阳性的PCR 产物，将回收产物连接到pGM-T 载体上，然后进行转化。步骤如下：

（1）按照连接体系中的顺序将试剂加入到1.5 mL离心管中（连接体系见表7）；

表7 连接反应体系Table 7 Connection reaction system

（2）轻弹离心管，混匀内容物，并短暂离心，放入16 ℃金属浴中连接16 h；

（3）将50 μL DH-5α 感受态细胞加入到上面步骤获得的连接产物中，轻轻混合，冰浴30 min；

（4）将离心管置于42 ℃水浴90 s，取出离心管立即冰浴2~3 min；

（5）向离心管中加入500 μL 预热的SOB 培养基，置于 37 ℃摇床，以 150×g 培养 45 min；

（6）将菌液在离心管中混合后，将100 μL 菌液接种到氨苄青霉素抗性的LB 固体培养基，用无菌的玻璃涂布器涂开细胞，在培养箱中孵育12~16 h；

（7）从每个平板上挑取单个菌落放入含有50 μL SOB 液体培养基的离心管中，将其作为模板进行菌落PCR（PCR 体系见表5，反应条件见表6），并用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，送由哈尔滨擎科生物技术有限公司测序。

1.2.5 同源性及系统进化树构建分析

对测序所得毒株与参考毒株用Lasergene DNASTARTM5.06 进行序列比对以及同源性分析。采用NJ 法分析遗传演化结构，利用MEGA 6.06 软件中p-distance 模型构建进化树。

2 结果与分析

2.1 BAstV ORF1a 基因扩增结果

为调查黑河市某规模化奶牛养殖场中BAstV 的感染情况，通过RT-PCR 对采集的15 份样品进行BAstV 检测，结果显示，检测出BAstV 阳性样本3 份，阳性率为20%。扩增得到大小约376 bp 的片段，与预期大小相符（图1）。以上数据说明，该场的15 份粪便样品中确定有3 份样本为牛星状病毒阳性感染。

图1 ORF1a 基因扩增结果Fig.1 The amplification of the BAstV ORF1a genes

2.2 菌落PCR 扩增结果

将挑选出的单个菌群进行PCR 鉴定，需要保证该菌落中含有ORF1a 基因的阳性质粒琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增片段与目的片段大小相符，成功获得阳性菌落（图2）。

图2 菌落PCR 结果Fig.2 The result of individual bacterial colonies PCR

2.3 BAstV ORF1a 基因序列同源性分析

对成功获得的2 株BAstV ORF1a 基因序列进行ORF1a 基因序列比对和同源性分析，结果显示，鉴定毒株ORF1a 基因与我国BAstV 四川流行毒株（登录号NC_037655.1）核苷酸与氨基酸同源性较高，核苷酸同源性分别为96.6 和97.3 %，推导的氨基酸同源性分别为99.4%和100%；而其与嗜神经型BAstV 欧洲毒株（KX266908.1）相比核苷酸同源性较低，为36.7%和 37.4%（图 3，图 4）。

图3 ORF1a 基因核苷酸同源性分析Fig.3 Nucleotide homology analysis of ORF1a genes

2.4 BAstV ORF1a 基因系统进化树分析

通过MEGA 6.0 软件对本试验鉴定的BAstV 毒株和GenBank 数据库中选择的38 个毒株进行对比，利用NJ 法建立系统进化树进行遗传进化分析，结果显示，试验鉴定的两株BAstV 在进化树上单独聚于一支，与中国四川、广西、香港BAstV 毒株遗传距离较近，与日本、乌拉圭、欧洲BAstV 毒株遗传距离较远（图 5）。

3 讨论

自1978 年首次在英国患有肠炎的犊牛排泄物中发现BAstV 以来，BAstV 频繁在腹泻及健康犊牛中被检测到，牛肠道型星状病毒经常与牛轮状病毒、牛诺如病毒合并感染并促进腹泻加重[18]。当前，世界范围内BAstV 流行情况复杂。多个国家和地区相继检测出 BAstV。Oem J K 等[19]研究表明，2014 年韩国

腹泻牛粪便样品中BAstV 阳性率为7.82%（9/115）。Marcelo C[20]研究表明，2015 年巴西牛粪便样本中检测到 14.3%（39/272）的 BAstV。Nagai M 等[21]研究表明，2015 年日本牛粪便样品中 BAstV 阳性率为10.27%（15/146）。Sharp CP 等[22]研究表明，2015 年苏格兰AstV 在犊牛中的阳性率高达74%（85/115），成年牛阳性率为 15%（3/20）。Mohamed FF 等[23]研究表明，2016 年埃及BAstV 粪便样本中检测出阳性率为 32%（8/25）。Turan T 等[24]研究表明，2018 年土耳其 BAstV 的阳性率为 3.15%（4/127）。Matías C 等[25]研究表明，2019 年乌拉圭BAstV 的阳性率为26%（128/500）。在我国，广西、四川、青海、重庆、河南、川西北等地区BAstV 感染率从2.7%到60.3%不等[14-17]。研究对黑龙江省黑河市某规模化奶牛养殖场15 份犊牛腹泻样本进行BAstV 检测，结果表明，15 份腹泻样本中BAstV 阳性率为20%（3/15），研究首次在黑龙江地区检测到BAstV。这些数据表明，在不同的国家和地区，BAstV 的流行情况存在差异。另外，除在肠道中检测BAstV 外，欧洲学者在出现神经症状的脑组织也检测到嗜神经型BAstV，BAstV 可能严重侵害了牛的中枢神经系统，导致牛化脓性脑炎的爆发，家畜的中枢神经系统传染病具有重要的经济和公共卫生意义[26]。因此，建议在商业养殖牛场中开展大规模BAstV 监测研究，以准确评估该病毒在牛中传播的多样性和流行病学[27-28]。

BAstV ORF1a 在BAstV 复制过程中编码与病毒复制和转录相关的非结构蛋白，同时也是BAstV 的进化分析的主要目的基因[29-30]。研究也利用ORF1a 的部分序列进行了序列分析，结果表明，研究鉴定的2株BAstV 毒株ORF1a 基因核苷酸与氨基酸同源性为99.3%和99.4%，2 株毒株与我国BAstV 四川流行毒株、香港经典毒株核苷酸与氨基酸高度同源，而其与嗜神经型BAstV 欧洲毒株相比，核苷酸与氨基酸同源性较低，表明是肠道毒株与嗜神经毒株序列可能存在巨大差异；通过系统进化树分析也揭示了相同的结果，试验鉴定的BAstV 毒株与国内的流行毒株亲缘关系较近，与国外嗜神经型毒株亲缘关系较远。研究结果显示黑龙江省黑河市某规模化奶牛养殖场BAstV 的感染率为20%，这也是首次验证了BAstV 在黑龙江省的存在，为进一步全面了解该病毒的流行病学和生物学特征提供一定的参考依据。

4 结论

研究在黑龙江黑河市某规模化养牛场15 份犊牛腹泻粪便样本中检测到BAstV，其检出率为20%。证实了BAstV 在我国黑龙江地区的传播。另外，研究测序的2 株毒株与香港经典肠道毒株和国内近几年流行的肠道毒株具有高度同源性，但与欧洲嗜神经型毒株同源性较低，进一步证实肠道毒株与嗜神经毒株序列之间可能存在显著差异。研究为我国BAstV的进一步研究提供基础数据，丰富了我们对中国BAstV 基因进化的理解。