基于N-卤胺化合物的聚乙烯醇/黄原胶抗菌膜的制备及性能

郑玉霞,左梦迪,殷茂力,刘 颖,任学宏

(江南大学 纺织科学与工程学院,生态纺织教育部重点实验室,江苏 无锡 214122)

1 前 言

皮肤是人体的重要器官,起着控制体温,防止感染及体液流失、免疫及传感的作用。表皮组织一旦破损,若不及时处理,将会造成渗出物的形成、胶原沉积不当,延缓创面愈合[1]。理想的伤口敷料,应为伤口提供物理保护屏障、有柔韧性和一定的机械强度、可吸收伤口渗出液、防止细菌感染,并为其创造一个清洁、潮湿的环境[2-3]。由于局部液体和半固体制剂不能在伤口表面停留足够长的时间,而干燥的传统敷料不能为伤口愈合提供一个潮湿的环境[4],因此近四十年涌现出大量关于新型敷料的研究。新型敷料的形式种类多样,如薄膜、水凝胶、水胶体、泡沫、海绵等[5]。

薄膜敷料由单面覆盖黏性物质的聚合物制成,它们多数外观透明,易于观察伤口变化情况,密切黏附在伤口处、能有效吸收伤口渗出液。聚乙烯醇(PVA)因具有良好的成膜性、生物相容性、优异的机械性能、细胞和蛋白质黏附小等特点,在医用材料领域受到广泛关注[6]。由于PVA 无毒性,故可作为药丸、药粒粘结剂,眼药水的增粘剂,它是目前国内药用辅料开发领域的研究热点之一[7]。另外,天然聚合物具有生物相容性和生物降解性,适用于生物医学领域。黄原胶(XG)是由单胞杆菌发酵所得的细胞外酸性杂多糖,是一种重要的生物高分子材料[8]。XG 可溶于冷、热水中,具有高黏度,高耐酸、碱、盐特性、高耐热稳定性、悬浮性和触变性等,被用作增稠剂、乳化剂、悬浮剂和稳定剂,广泛应用于食品、日用化工、医药、纺织等领域[9]。天然高分子与合成高分子相比,其机械强度相对较低,但通过与合成高分子交联或共混,可以改善天然高分子的机械性能[10]。

细菌是伤口感染的最主要原因,也是创面护理过程中的主要问题[1]。作为伤口敷料,必须具备抗菌效果,既能阻隔细菌及微生物对伤口的侵入,又能在已感染的伤口处有效的杀菌消炎,促进愈合。目前国内外对于抗菌剂的研究主要包括有机抗菌剂、无机抗菌剂、天然抗菌剂[11]等,但这些抗菌剂都存在一定缺点,比如抗菌能力弱、杀菌速度慢、价格昂贵等。近二十年来,N-卤胺类化合物作为有机抗菌剂中重要的一类,因其具有广谱抗菌、杀菌效果好、种类多、可再生等优点引起了广泛的研究热潮[12],并在近几年得到迅速发展。卤胺化合物是一种分子结构中含有氮卤官能团的有机化合物,它通常是由氮氢(N-H)键经次卤酸盐作用转变成氮卤(N-X)键进行制备,由于卤原子带有正电荷而具有氧化性,当接触到卤胺化合物会发生卤素交换反应,使微生物或细菌失活。1-氯-2,2,5,5-四甲基-咪唑啉哃(MC)就是一种N-卤胺类抗菌剂,化学式见图1。据报道,MC 化合物毒性低,有望应用于食品包装[13]。因此,将MC负载到伤口敷料中是一种便捷、高效的方法。

图1 MC结构式Fig.1 Structure of MC

1962年,Winter博士的研究表明,在湿性环境下,伤口愈合速度是干性环境下的两倍[14],湿性愈合敷料能对微生物起阻隔作用。本研究结合PVA 和XG 这两种高分子材料,添加甘油为保湿成分,采用制备功能性聚合物复合材料常用的方法-共混法,并将抗菌活性成分MC以乙醇为溶剂添加到整个体系中,制备了一种新型的基于N-卤胺化合物的抗菌膜PVA/XGMC。

2 实 验

2.1 实验材料与仪器

1,2-环氧-4-乙烯基环己烷(EVC);聚乙烯醇(PVA)1788 型,黄原胶(XG),甘油,乙醇和营养琼脂;1-氯-2,2,5,5-四甲基-咪唑啉哃(MC);MC3T3-E1 细胞、胰酶消化液、磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液、青霉素、MEMα 细胞培养基和胎牛血清;细胞计数试剂盒(CCK-8,biosharp BS350A)均为外购,且所有试剂均未进一步纯化。所用细菌为金黄色葡萄球菌(S.aureus)(ATCC 6538)和大肠杆菌(E.coil)(ATCC 8099)购自上海维塔化学试剂有限公司。

原子力显微镜(AFM)图片由Dimension ICON原子力显微镜在点触摸式下拍摄所得;万能材料测试机(3385H)测定各种膜的力学性能。酶标仪(Bio Tek Epoch 全波长酶标仪)记录光密度(OD)。

2.2 实验过程

2.2.1 PVA/XG 复合物的制备 配制一定质量分数的PVA 溶液(2%～12%)于烧瓶中,将烧瓶置于油浴锅,加热至90℃,待PVA 完全溶解后,将溶液温度降至70 ℃,加入适量EVC,搅拌反应约5 h后,向PVA/EVC 溶液中加入XG (占溶液质量比的0.5%),甘油(占溶液质量比的分别为3%、5%、7%、9%),继续搅拌12 h,将所得混合溶液命名为PVA/XG。

2.2.2 PVA/XG-MC 膜的制备 向所制得的PVA/XG 混合溶液中掺入一定质量占比(5%,10%,15%,20%,25%,30%)的MC 溶液(乙醇为溶剂;浓度分别为0.1%,0.2%,0.3%,0.5%,0.7%,1.0%),用玻璃棒将两组分充分搅拌均匀,再超声除泡(超声功率设置为500 W,超声30 min)。将所得PVA/XGMC混合溶液倒入洁净的玻璃培养皿中,室温下自然静置,待干燥后即得PVA/XG-MC膜。

2.3 力学性能测试

根据ASTM D3039 标准测定了膜的力学性能。通过拉伸试验测定膜的拉伸强度和在断裂点的伸长率。将实验样品裁剪成一个长方形 (30 mm×100 mm),并以5 mm/min 的拉伸速度进行测试。每种样品测试三次,取平均值,拉伸强度(σ)和断裂伸长率(δ)的计算方法如下:

式中:Nbreak和Asample分别为使膜拉断时所需的力(N)和试样截面面积(mm2);Lbreak为膜断裂点长度增加量(mm);Loriginal为原始长度。

2.4 水蒸气透过率的测定

按照ASTM(2010版标准)方法测定了几种膜的水蒸气透过率。取上口直径30 mm 的小烧杯,烧杯内装有30 m L 蒸馏水,将膜裁剪成直径稍大于30 mm的圆形并盖住烧杯口,用橡皮圈固定密封好。然后将试管放入30℃、相对湿度(RH)为(50±5)%的培养箱中,每24 h称重一次,将水的重量损失记录为时间的函数。用该函数中线性回归方程的斜率除以小烧杯的口面积来计算水蒸气透过率(WVTR),计算公式如下:

式中:S为线性回归方程的斜率(g/h);A为小烧杯的口面积(m2)。

2.5 氯含量的测定

采用碘量/硫代硫酸盐滴定法测定抗菌性PVA/XG-MC 膜 的 氯 含 量[12]。取 尺 寸 为2.54 cm ×2.54 cm的不同膜样品放入20 m L 的去离子水中,加入0.3 g碘化钾和2 m L 质量分数为1% 的淀粉溶液,室温搅拌30 min后溶液显深蓝色,用硫代硫酸钠溶液滴定,直至蓝色消失。使用式(4)计算所制备膜的含氯量CCe-(膜表面的氯的含量):

式中:N为滴定所用的硫代硫酸钠溶液的当量浓度(equiv/L),V为消耗硫代硫酸钠溶液的体积(m L),S为膜样品的面积(cm2),每种样品测三次,取均值。

2.6 抗菌测试

采用改进的AATCC 100-2004方法对PVA/XGMC膜进行抗菌效果测试,以PVA 和PVA/XG 膜作为对照组。实验采用的细菌为革兰氏阴性金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)和革兰氏阳性大肠杆菌(ATCC 8099),用移液枪吸取25μL的细菌悬浮液添加到膜样品(2.54 cm×2.54 cm)中心,再盖上另一片样品,为使样品与细菌充分接触,将灭菌后的砝码放置在上面。当接触时间达到5,10,30 min 后,将样品移至含有5 m L经高温灭菌后的硫代硫酸钠溶液的离心管中,以淬灭样品中的活性氯。涡旋2 min后,将离心管中溶液取适量,依次用磷酸缓冲溶液稀释10,100,1000倍,并分别取100μL接种至琼脂盘上。再转移至37℃培养箱,孵育24 h后,记录菌落数并计算杀菌结果。

2.7 体外细胞毒性测试

用MC3T3-E1细胞来研究所制备的膜的细胞相容性。首先将制备好的样品切片、称重,细胞接种前,用90% 的酒精浸泡20 min灭菌,然后用PBS溶液浸泡5 min进一步纯化。随后,将灭菌后的样品置于48孔板中,用适量MEMα培养基将样品浸泡24 h,得到浓度为0.001%的提取液。用培养基将提取液连续稀释5 次,得到不同浓度梯度的提取液(50,25,12.5,6.25,3.125 mg/L)。将MC3T3-E1细胞接种于96孔板上,细胞密度为0.3×104个细胞/孔。在37℃、含5%CO2的培养箱中培养1 d后,实验组将培养基更换为提取液,对照组更换新鲜的MEMα培养基。每个样本进行三次重复实验。然后再培养MEMα1 d,使用细胞计数Kit-8(CCK-8)测定试样对于MC3T3-E1细胞的细胞毒性。用酶标仪测定样品在450 nm 处的吸光度(ODsample),以PBS 溶液在此波长处OD 值(ODblank)为空白对照,通过式(5)测定细胞存活率:

3 结果与讨论

3.1 工艺影响因素

3.1.1 PVA 浓度对膜的影响 在PVA 与EVC物质的量比为2∶1,添加0.5%(质量分数,下同)黄原胶、5% 甘 油,并 掺 入25% 的MC 溶 液 (浓 度 为0.7%)的条件下,考察PVA 浓度对于所制PVA/XGMC膜的影响。图2 所示膜的尺寸均为15 mm×35 mm×1.5 mm。研究结果表明:当PVA 浓度较低(2%、4%)时,所制备溶液偏稀、成膜效果差、且成膜时间长;当PVA 浓度较高时,掺入XG 后,由于XG 的增稠效果好,使得混合溶液过于浓稠,使用不便。此外从图中还可以看出PVA 浓度对于所制薄膜外观、手感和透明度影响不大。综合考虑,选择PVA 浓度为8%。

图2 PVA 浓度(a-2%;b-4%;c-6%;d-8%;e-10%;f-12%)不同时所制备的PVA/XG-MC膜的照片Fig.2 Photographs of the prepared PVA/XG-MC membrances with different PVA concentrations(a-2%,b-4,c-6%,d-8%,e-10%,f-12% )

3.1.2 EVC含量对膜力学性能的影响 在PVA的浓度为8%,添加0.5% XG(质量分数,下同)、5%甘油,并掺入25% 的MC 溶液(浓度为0.7%)的条件下,考察PVA 与EVC物质的量比对于所制膜的力学性能的影响。从表1可以看出:当PVA 与EVC 的物质的量比逐渐减小时,即所添加的EVC 的量越小,所得膜材料的拉伸强度越低,但断裂伸长率有所增加,可见PVA 通过与EVC 的加热共混反应并添加XG、甘油和MC后,变得相对较柔韧,即相较于原PVA,拉伸性能均有提高。PVA/XG-MC 膜力学性能的变化可能是由于PVA 与EVC和XG 之间的共同作用产生的。图3为原PVA 膜(图3a)与采用PVA 与EVC的物质的量比为2∶1时所得到的PVA/XG-MC膜(图3b)。从图3可以看出:在相同条件下所制得的两种薄膜,在成膜后立即查看,原PVA 膜干燥透明,有塑料手感,不易被拉伸;而PVA/XG-MC膜柔软,易被拉伸并产生形变(图3c)。另外,在实验过程中发现当EVC的添加量较大时(PVA 与EVC物质的量比小于1),所得PVA/XG-MC 膜暴露在自然环境下约12 h后表面会出现类似油状物,可能影响后续使用。考虑此,优选PVA 与EVC的物质的量比为2∶1。

图3 (a)PVA 膜与(b)当PVA 与EVC物质的量的比为2∶1时所得PVA/XG-MC膜;(c)拉伸后的PVA/XG-MC膜Fig.3 (a)PVA membrance,(b)PVA/XG-MC membrance with PVA to EVC was 2∶1,(c)The PVA/XG-MC membrance after tensile

表1 PVA与EVC物质的量比与所得膜的力学性能关系Table 1 Influence of the molar ratio of PVA to EVC on mechanical properties

3.1.3 甘油添加量的影响 在PVA 的浓度为8%,PVA 与EVC 物 质 的 量 比 为2∶1,添 加0.5%XG,并掺入25% 的MC溶液(浓度为0.7%)的条件下,考察甘油添加量对于所制膜的水蒸气透过率的影响。由图4可知,PVA 膜(图4a)的水蒸气透过率较低(80 g/(m2·h)-1);当PVA 与EVC以物质的量比为2∶1经共热反应,并添加0.5%XG后所制得的膜(图4b)的水汽透过率大幅提高(141 g/(m2·h)-1),该结果可能归因于XG 良好的亲水性。添加甘油后(图4 c～f)水蒸汽透过率进一步提高。当所添加的甘油占混合溶液的质量比为5% 时,所制膜的水蒸汽透过率为153 g/(m2·h)-1;随着甘油添加量的进一步增大,水蒸汽透过率的增幅渐缓,因此优选甘油添加量为5%。

图4 甘油添加量对膜的水蒸气透过率的影响(a.PVA 膜,b-f.PVA/XG-MC膜,其中甘油的质量占比依次为0%,3%,5%,7%,9%)Fig.4 Influence of glycerin content on water vapor transmission rate of membrance(a.PVA membrance,b-f.PVA/XG-MC membrance,the mass ratios of added glycerin were 0%,3%,5%,7%,9%,respectively)

3.1.4 乙醇添加量的影响 在PVA 的浓度为8%,PVA 与EVC 物质的量的比为2∶1,添加0.5%XG、5% 甘油的条件下,考察乙醇添加量对于PVA/XG 混合溶液储存状态的影响。从图5可以看出:随着乙醇添加量的的增加,PVA/XG 混合溶液由浓稠的乳白色酸奶状逐渐变为透明的胶水状,但当乙醇的质量占比达到30% 时,经30 d的静置储存后可明显发现,该混合溶液中出现了白色絮状析出物,猜测可能是不溶于乙醇的XG 在掺入大量乙醇后析出。所以,优选了乙醇的添加量为25%。

图5 乙醇添加量对于PVA/XG 混合溶液储存状态的影响a-g添加的乙醇质量占比依次为0%,5%,10%,15%,20%,25%,30%Fig.5 Effects of ethanol dosage on storage state of PVA/XG mixed solution.a-g.The mass ratios of the added ethanol were 0%,5%,10%,15%,20%,25%,30%,respectively

3.1.5 MC 浓度的影响 在PVA 的浓度为8%,PVA 与EVC物质的量比为2∶1,添加0.5% XG、5%甘油的条件下,以乙醇为溶剂配制了不同浓度的MC溶液(0.1%,0.2%,0.3%,0.5%,0.7%,1.0%),将MC溶液以25% 的质量占比添加到PVA/XG 混合溶液中,充分搅拌均匀得PVA/XG-MC 混合溶液,考察MC溶液浓度对于所制PVA/XG-MC 膜的氯含量的影响。由图6可知,随着MC 溶液浓度的增大,所得PVA/XG-MC膜的氯含量越高。当N-卤胺类抗菌膜的氯含量达到6.28×1017atoms/cm2时,可分别在5 min和1 min内杀死对数值约为6.07的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌[15]。据此,本研究选择MC溶液浓度为0.7%,即可制得氯含量为8.30×1017atoms/cm2的抗菌性PVA/XG-MC膜。

图6 MC浓度对所制的PVA/XG-MC膜中氯含量的影响Fig.6 Effect of MC concentration on the chlorine content in the prepared PVA/XG-MC membrance

综上所述,各组分的最佳工艺参数为:8% PVA溶液,PVA 与EVC 物质的量比为2∶1,添加0.5%的XG,甘油质量占比为5%,以25%的质量占比向混合溶液中加入MC溶液。此外,对于PVA/XG-MC膜的制备,选择了MC溶液浓度为0.7%,进行接下来的表征与测试。

3.2 AFM 分析

从图7(a)可见纯PVA 膜表面呈较为平整的微观结构。而PVA/XG 膜(图7(b))表面呈非常规则的网络结构,这种明显的形貌差异可能是由于XG 的掺入而产生的。XG 侧链的丙酮酸基团和乙酰基可通过氢键或静电作用反向缠绕主链形成棒状螺旋的二级结构,并进一步通过非共价键作用形成更复杂的网状螺旋复合体结构[16]。一方面,XG 主、侧链上含有大量的羟基、羧基、成缩酮等活性基团,在与PVA 和EVC共混且受热的条件下部分发生键合,形成类似于“交联”的效果。另一方面,XG 在水溶液经80 ℃处理后会产生分子构象变化:当溶液较浓,XG的双螺旋结构从两端展开,但不分裂成两条单链。降温复性过程中,XG 二聚体会发生不匹配单链之间的聚集[17]。在本实验中,XG 经历了从70 ℃冷却至室温的过程,推测温度变化对图7b中网络结构的形成也具有一定作用。此外如图7(c),添加了N-卤胺抗菌剂MC的PVA/XG-MC(8.30×1017atoms/cm2)膜与PVA/XG 相比,微观形貌上没有明显的变化,仍然呈网络结构。

图7 三种不同膜的AFM 图片 (a)PVA 膜,(b)PVA/XG 膜,(c)PVA/XG-MC膜(氯含量为8.30×1017 atoms/cm2)Fig.7 AFM images of different membrances (a)PVA membrance,(b)PVA/XG membrance,(c)PVA/XG-MC membrance(The chlorine content is 8.30×1017 atoms/cm2)

3.3 抗菌结果

以纯PVA 膜和PVA/XG 膜为对照样,氯含量为8.30×1017atoms/cm2的PVA/XG-MC膜为测试样,分别接种了1.32×106(6.12 log)CFU/试样和1.12×106(6.04 log)CFU/试样的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,进行抗菌性能测试,所得测试结果参见表2。从表中可以看出纯PVA 膜和PVA/XG 膜对两种细菌均表现出了一定的“抑制”作用,两种细菌都有一定的减少,这是由于部分细菌黏附在了膜表面[15]。且PVA/XG 膜较PVA 膜对细菌的减少量更大,该结果可能是由于PVA/XG 膜具有更好的亲水性,可以黏附更多的细菌。但当掺入MC 后所得的PVA/XGMC膜具有优异的抗菌性能,可在5 min内杀死所有接种的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。PVA/XG-MC膜中所含的卤胺化合物MC 能通过将共价键合氯或解离氯转移到细菌表面,从而使微生物失活。

表2 PVA/XG-MC对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌结果。Table 2 Antibacterial property of PVA/XG-MC against S.aureus and E.coli.

图8(a1)、(b1)分别为原接种的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在培养基中的生长情况,(a2/a3)、(b2/b3)分别是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌与PVA膜、PVA/XG 膜接触30 min后再接种培养所得菌落照片。a4和b4代表大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别与PVA/XG-MC膜接触5 min后接种培养后的情况,可见细菌与PVA/XG-MC 膜接触5 min后就已被全部杀死。

图8 抗菌结果图片(a-大肠杆菌,b-金黄色葡萄球菌)1-对照组,原菌接种;2-细菌与PVA 接触30 min;3-细菌与PVA/XG接触30 min;4-细菌与PVA/XG-MC(8.30×1017 atoms/cm2)接触5 minFig.8 Photographs of the antibacterial efficacy(a-E.coli,b-S.aureus).1-controls,the original bacteria inoculation,2-the bacteria contacting with PVA for 30 min before inoculation,3-the bacteria contacting with PVA/XG for 30 min before inoculation,4-the bacteria contact with PVA/XG-MC(8.30×1017 atoms/cm2)for 5 min before inoculation

3.4 细胞毒性

通过间接接触法测定了PVA 膜、PVA/XG 膜和PVA/XG-MC(8.30×1017atoms/cm2)膜对于MC3T3-E1细胞的细胞毒性,以研究它们的细胞毒性。细胞经过不同浓度的提取液孵育24 h后,细胞存活率结果如图9所示。对于PVA 和PVA/XG,使用浓度为0.000313%～0.001%的样品提取液培养细胞,所得结果显示细胞存活率均超过了80%;对于PVA/XG-MC,细胞存活率与提取液浓度呈负相关,即提取液浓度越高,细胞存活率越低,该结果可能是由于MC分子内活性氯的存在造成的[18]。即使提取液浓度达到0.001%,细胞存活率也有69.4%。结果表明,所制备的PVA/XG-MC 膜对MC3T3-E1细胞不具有明显的细胞毒性。

图9 PVA,PVA/XG 及PVA/XG-MC(8.30×1017 atoms/cm2)膜对MC3T3-E1细胞的细胞毒性Fig.9 Cytotoxicity of PVA,PVA/XG and PVA/XG-MC(8.30×1017 atoms/cm2)membrance to MC3T3-E1 cells

4 结 论

本研究制备出一种基于N-卤胺化合物的聚乙烯醇/黄原胶抗菌膜(PVA/XG-MC)。通过工艺探究得到各组分的最佳工艺条件为:8%PVA,PVA 与EVC物质的量比为2∶1,0.5%XG,5% 甘油,MC溶液的添加量为25%。当添加的MC 溶液浓度为0.7% 时,PVA/XG-MC膜的氯含量为8.30×1017atoms/cm2;经测定该膜的拉伸强度为(15.02±1.4)MPa,断裂伸长率为(216±8)%,水蒸气透过率为153 g/(m2·h)-1。对制备的抗菌性膜进行了AFM 表征,发现PVA/XG-MC膜呈网络结构。抗菌测试结果表明,所制备的PVA/XG-MC膜可在5 min内将6.12 log的金黄色葡萄球菌和6.04 log的大肠杆菌全部灭活,显示出优异的抗菌效率。通过体外细胞毒性测试评价了膜材料对于MC3 T3-E1细胞的细胞毒性,结果表明所制备的膜具有较好的细胞相容性。综上,所制得的PVA/XG-MC抗菌膜具有良好的机械性能,且透水蒸气性好、杀菌效率高、细胞毒性低,因此具有作为医用敷料的潜力。