石豆兰内生细菌分离鉴定、发酵条件优化及对棉花枯萎病菌的抑制

苗永美，韩 朔，苗翠苹，张 维，徐荣华

1安徽科技学院生命与健康科学学院，凤阳 233100；2云南大学生命科学学院，昆明 650504

植物内生菌是指寄生于植物活体组织、器官内的细菌、真菌和放线菌等微生物，几乎每种植物体内都含丰富菌物，内生菌经过长期进化逐渐与寄主形成共生关系，不会引起明显的宿主植物外在感染症状。研究表明内生菌次级代谢产物不仅能抑制病原微生物，还可以激活宿主植物的免疫应答系统，增强植物防御相关基因的表达谱[1,2]，也是天然药物重要来源[3]。微生物农药因绿色环保及对农副品品质影响小等优势已成为21世纪农药新产业，代表着植保方向。兰科植物因其生境内生菌更为丰富，Chen等[4]从5种兰科药用植物(白芨、手参、金钗石斛、束花石斛、金线莲)分离到241株内生菌。作者前期在开展石豆兰属植物(Bulbophyllumsp.)离体培养时发现其组织内生菌丰富[5]，有些菌能与寄主离体组织共生。枯萎病是棉花种植期一种常见病害，全国各主要产棉区普遍发生，危害严重，估计每年因枯萎病损失皮棉1亿公斤。枯萎病由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)引起，该病原菌根据寄主特异性被划分为不同专化型，如棉花专化型、黄瓜专化型、香蕉专化型等，有些专化型又根据寄主品种被进一步划分为不同生理小种[6]，并形成了与其他国家不同独特生理小种[7]。不同专化型及生理小种引起的枯萎病需要不同防治方法[8]，因此找准尖孢镰刀菌不同专化型及其生理小种的生防菌尤为重要。本试验以尖孢镰刀菌棉花萎蔫专化型为指示菌，从石豆兰属植物内生菌中寻找具抑制效果的生防菌，优化发酵条件，电镜观察主要抑菌物质脂肽对病原菌形态影响。本实验为抑菌物质的制备进而为棉枯病的生物防治奠定实践基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

石豆兰属植物采自福建屏南鸳鸯猕猴自然保护区；尖孢镰刀菌棉花枯萎专化型(F.oxysporumf.sp.vasinfectum)，由本校农学院段海明博士提供。

1.2 培养基

分离培养基：NA、金氏、YPD、LB、大豆酪蛋白、YG、R2A共7种；指示菌培养用PDA培养基；筛选培养基为LB；发酵培养基以LB为基础，添加不同C、N。

1.3 方法

1.3.1 内生菌分离

植株表面洗净、吸干水分，叶片、假鳞茎、横走茎和根分别剪下，75%酒精处理30 s，无菌水漂洗3次，0.1%HgCl2消毒8 min，无菌水洗5次。材料切碎，按1∶20加无菌水研磨，涡旋混匀，梯度稀释。取100 μL菌悬液涂布于分离培养基上，30 ℃培养4天。据菌落颜色、大小、形态等特征挑菌落，划线多次纯化。

1.3.2 活性菌筛选

对峙法初步筛出具抑菌活性菌株，琼脂小柱法复筛。复筛步骤：活性菌活化，30 ℃，180 r/min条件下培养12 h得种子液，2%接种量接入LB(装量20 mL/50 mL)发酵3 天，离心，上清微孔膜过滤，与PDA按1∶10混合制平板。病原菌活化，打孔器(d=0.8 cm)沿边缘打菌饼、倒扣在复筛平板中央，LB代替发酵液做对照，28 ℃培养4天，十字交叉法测量菌落直径。抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。

1.3.3 菌种鉴定

抑菌效果最好菌株BBs-27做分子鉴定。PowerSoilRDNA Isolation Kit试剂盒提取总DNA，用引物(PA：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和PB：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)PCR扩增16S rDNA、测序，NCBI数据库中搜索，选取近缘菌种，以大肠杆菌为外支，MEGA 7.0软件中Muscle序列比对，选用Kimura2-parameter距离模型计算进化距离，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树(Bootstrap值=1 000)。

1.3.4 发酵液不同灭菌处理

BBs-27发酵液上清依次用0.45 μm、0.22 μm微孔膜过滤和121 ℃高温处理15 min。

1.3.5 发酵条件优化

单因素有碳源、氮源，pH、温度和时间。据单因素结果，选蔗糖、(NH4)2HPO4、时间和温度为自变量，抑菌率为响应值，利用Design-Expert 8.0.5软件进行4因素3水平Box-Behnken设计，其他条件为：LB为基础培养基，pH=5，180 r/min。重复3次。

1.4 脂肽制备及对尖孢镰刀菌形态影响

酸沉醇提法制备脂肽：7 mol/L盐酸调pH=2，过夜沉淀；4 ℃、5 000 r/min离心20 min，甲醇多次抽提，蒸发浓缩，35 ℃真空干燥1天，称重，计算产量。

配制10 mg/mL脂肽原液，过滤除菌，添加至PDA培养基中使脂肽终浓度为0.02～1 mg/L，按“1.3.2”方法抑菌试验。菌丝喷金后用型号FEIQuanta-200扫描电镜观察菌丝形态和孢子。

1.5 数据处理与分析

Excel绘图，Design-Expert 8.0.5软件响应面设计，SPSS 18.0多重比较。

2 结果与分析

2.1 活性菌筛选

从4种组织中共分离到39株细菌，两级筛选到13株有抑菌活性，抑菌率在5.77%～60.78%之间，其中27号菌抑菌率最高，根据编号和来源命名为BBs-27。

2.2 菌株鉴定

菌株BBs-27的16S rDNA序列在GenBank数据库进行Blast，利用Mega7软件进行聚类分析构建系统发育树(见图1)，与Bacillussubtilissubsp.subtilisstrain168相似性为98.93%，系统发育树上属同一分支，说明它们之间亲缘关系最近。

2.3 发酵液不同处理方式对抑菌率影响

经过微孔滤膜过滤和湿热高温灭菌处理后的发酵液抑制率分别为56.12%和51.57%，说明高温对抑菌物质活性有一定影响，但抑菌活性仍然较好，证明主要抑菌物质热稳定性高。由于过滤处理操作费力费时、污染率高等，后期试验用湿热灭菌法除菌。

2.4 单因素试验结果

2.4.1 碳源

以LB为基础培养基，BBs-27发酵液抑菌率为51.57%，除了2.5%～3.0%木糖外，其他糖添加都能显著提高抑菌率，尤其添加2.0%～2.5%蔗糖时其抑菌率显著高于其他处理，而两者之间差异不显著(见表1)。

表1 不同碳源对抑菌率影响

2.4.2 氮源

LB中分别添加0.05%～0.2%的7种氮源，发酵物抑菌率在66.59%～80.39%之间都显著性高于对照，0.05%(NH4)2HPO4时抑菌率最高，为80.39%，结果见表2。

表2 不同氮源对抑菌率影响

2.4.3 初始pH

初始pH对抑菌率影响见图2，抑菌率会随着pH增大先升高后降低，pH=5时发酵物的抑菌率最高，为74%，显著高于其他pH。

图2 初始pH对抑菌率影响

2.4.4 发酵温度

发酵温度会显著影响抑菌物质合成(见图3)，抑菌率随着温度升高先增大后减小，40～42 ℃的抑菌率显著高于其他处理，但两者之间差异不显著。

图3 发酵温度对抑菌率影响

2.4.5 发酵时间

4个发酵时间的产物抑菌率有明显差异(见图4)，抑菌率随着发酵时间延长先升高后降低，发酵96 h时，抑菌率最高，为58.82%。

图4 发酵时间对抑菌率影响

2.5 响应面试验结果

响应面试验结果见表3和表4。

表3 Box-Behnken试验设计与结果

表4 模型方差分析

2.5.1 回归模型建立与分析

根据单因素实验结果，选择蔗糖、(NH4)2HPO4、温度和时间四因素、三个水平，根据Box-Behnken设计原理构建响应面试验设计(见表3)。1～24号是析因实验，25～29号为中心实验。

2.5.2 方差分析

利用Design Expert V8.0.6对表3数据多元回归拟合分析，得回归方程：Y=4585.03-28.79A-1401.75B-216.53C+3.00D+32.35AB-0.47AC+0.42AD+29.90BC+0.10BD-0.11CD+2.90A2+287.91B2+2.66C2+3.64×10-3D2。

表4所示，回归模型极显著(P<0.000 1)，失拟项P=0.153 1(>0.05)，说明模型失拟不显著，R2=0.9551(>0.75)，Radj=0.910 2，说明模型拟合度较高，实验误差小，可用来分析和预测抑菌物质合成发酵条件。A、B、C、C2对抑菌率影响极显著(P<0.01)；其次AD、BC和CD的影响显著(P<0.05)。根据F值大小说明对抑菌率影响的大小顺序依次为C>A>B>D。

2.5.3 发酵条件响应面分析及优化

为了更直观探讨上述因素之间的交互影响，固定任意两个因素，考察另两个因素间的交互作用，如图5所示。根据响应面走势、等高线密集，形状，存在显著交互作用的两因素且从大到小依次是BC、CD和AD，其他相互作用不显著。通过软件分析得到最优化值为蔗糖2.49%、(NH4)2HPO40.01%，温度40.14 ℃，发酵时间105.56 h，此条件下，模型预测抑菌率为88.82%。

图5 两因素交互对抑菌率影响的响应面图

2.5.4 发酵参数修正及验证试验

为操作方便，实际工艺参数修正为2.5%蔗糖、0.01%(NH4)2HPO4，40 ℃，105 h。依据上述参数进行发酵抑菌试验，抑菌率均值为88.06%，与预测值基本一致，相对误差为0.86%，说明该模型能较好地预测抑菌物质产率，测产脂肽产量为0.6g(干重)/L。

2.6 脂肽对尖孢镰刀菌生长影响

添加0.02～1 mg/L脂肽对尖孢镰刀菌棉花枯萎专化型的抑菌率在9.71%～70.29%范围内，根据线性方程Y=0.058 9X+21.202，脂肽的半抑菌率IC50为488.93 μg/L。脂肽对病原菌有明显抑制作用，表现为菌落变小，纵向生长，颜色为浅黄色；而对照组菌丝中央为红色，新长出菌丝为白色(见图6)。电镜观察发现脂肽处理组菌丝膨大变形，粗细不均、有大量分生孢子(见图7)，说明菌体处于逆境状态，生长受到抑制。

图6 脂肽对尖孢镰刀菌抑菌效果

图7 发酵液对尖孢镰刀菌菌丝形态的影响

3 讨论与结论

尖孢镰刀菌能引起植物根腐病、枯萎病和黄化病[9]。用于棉枯病的生防菌主要有哈茨木霉TH-1[10]、绿色木霉GY20[11]、海洋链霉菌ZW-1[11]、壮观链霉菌SC11[13]、短小芽孢杆菌[14]、解淀粉芽孢杆菌SN06[15]、蜡状芽孢杆菌YUPP-10[16]等。因为尖孢镰刀菌存在不同专化型和生理小种，本研究所用尖孢镰刀菌病原菌从本校试验田发病棉花植株中分离，属于棉花萎蔫专化型，以抑制该病原菌的拮抗菌为筛选目标，从石豆兰属植物中筛选到一株具较好抑制作用的细菌，命名为BBs-27，分子鉴定与枯草芽孢杆菌亚种相似性最高。芽孢杆菌属的很多种具有广谱抗菌活性，具抑菌效果有枯草芽孢杆菌[17]、地衣芽孢杆菌[18]、瓦雷兹芽孢杆菌[19]、解淀粉芽孢杆菌[20]和蜡样芽孢杆菌[21]等类型。

抑菌物质的发酵受培养基和环境因子影响较大[22]，通过优化培养基组成和发酵条件会提高抑菌物质产量。Liu等[23]用优化后的培养基发酵莫海威J7，抑菌物产量提高了38.89%，Chen等[24]优化了解淀粉芽孢杆菌SC1150菌株发酵培养基，对香蕉枯萎病4号生理小种的抑菌圈直径由23.31增加到28.33。本研究中除了含2.5%～3.0%木糖培养基中没有抑菌物质产生，其他糖添加都能促进抑菌物质产生；LB中只含有机氮，添加0.05%无机氮源(NH4)2HPO4能提高抑菌活性，优化后抑菌率由51.57%提高到88.06%，脂肽产量为0.6g(干重)/L，比枯草芽孢杆菌HS-A38及诱变菌株的产量均高[25]，Zhang等[26]对B.subtilisATCC2133产脂肽条件进行了优化，HPLC法测定含量为4.885 g/L，这可能因菌株及检测方法有关。

产生抗菌脂肽微生物有多种，如细菌、放线菌、真菌等，其中芽孢杆菌是发现产脂肽最多的属类，不同微生物产生的脂肽具不同结构、特性和不同抑菌效果[27]。本研究所用的BBs-27产生的抑菌物质有些耐高温、有些高温下失活，说明抑菌物质有多种，但主要抑菌物质是耐121℃高温处理的。根据脂肽理化性质和本试验脂肽的抑菌效果，推测出BBs-27产生的抑菌物质主要是脂肽。已开展的另一部分研究表明其他高温失活的抑菌物质可能是蛋白质，抑菌蛋白的相关研究及脂肽结构等工作有待进一步开展。