大黄总多酚、总蒽醌含量测定及体外抗氧化作用的谱效关系研究

李东辉，吴红伟，李国峰，杨新荣，李咸慰，宋沁洁，李 阳，李越峰*

1甘肃中医药大学；2甘肃省中药制药工艺工程研究中心，兰州 730000

1956年，Harman提出自由基衰老学说，氧化反应是诱导生物衰老与诱发多种疾病的主要起因，其中自由基主要由线粒体呼吸链电子泄露产生或经酶促反应催化产生，包括氧自由基与其他自由基[1]。一些活性物质可直接或间接作用于自由基，以逆转自由基对机体细胞的氧化攻击。当前，如丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲醚、没食子酸丙酯等合成型抗氧化剂均具有一定的细胞毒性[2]。因此，从食品类、香料类及天然产物中寻找高效、低毒的抗氧化剂也倍受关注。DPPH法和ABTS法可用于大样本测定及亲水性和亲脂性物质的抗氧化能力测定。因此，有必要从天然产物中寻找高效、低毒抗氧化剂。大黄为我国传统大宗中药材，源于蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根和根茎，主要含有游离型与结合型蒽醌类衍生物、鞣质类、二苯乙烯苷类、多酚类等成分[3]，具有泻下、抑菌、止血、抗氧化等药理作用[4]。现已有研究表明，大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷及总蒽醌苷与体外抗氧化活性呈正相关[5]。没食子酸、儿茶素或表儿茶素[6]、2-O-桂皮酰-没食子酰葡萄糖等8种成分对ABTS自由基的清除能力较强[7]。

传统筛选活性化合物的方式常采用分离、纯化等，这无疑增大了劳动强度，且成本高耗时长。当前，谱效关系已被广泛用于中药有效成分筛选，它是指通过建立指纹图谱与药效学实验，利用数学软件和计算机技术“谱”与“效”联系起来，这种方法符合中医药理论体系[8]，又弥补了目前以化学指纹图谱控制中药质量的不足。中药指纹图谱质和量的特征和中药材生物学活性研究结果相联系建立关联数学表达式可用于评价中药材质量。因此，本研究以HPLC法建立“谱”，以DPPH法及ABTS法建立体外抗氧化“效”，并测定20批大黄的总多酚含量，总蒽醌含量，旨在研究大黄化学成分与体外抗氧化作用之间的联系，以便获得大黄潜在抗氧化有效成分群。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪(美国Agilent科技公司)；UV-power型紫外分光光度计(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)；BT125D型十万分之一分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；PL-S60型康士洁牌数码超声波清洗机(东莞康士洁超声波科技有限公司)。

1.2 试剂

甲醇、乙腈、磷酸(色谱级，天津市大茂化学试剂厂)；无水碳酸钠(分析纯，烟台市双双化工有限公司)；无水乙醇(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；1，1-二苯基-2-苦基肼(批号：S21J11M116469，DPPH)、2，2-联氨-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(批号：CAS#30931-67-0，ABTS)，均由上海源叶生物科技有限公司提供；福林酚试剂(分析纯，上海展云化工有限公司)；儿茶素(批号：PS020094)、表儿茶素(批号：PS010585)、没食子酸(批号：PS000688)、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷(批号：PS010709)、大黄酸-8-O-葡萄糖苷(批号：PS0011174)、大黄素-1-O-葡萄糖苷(批号：PS011196)、大黄酚-8-O-葡萄糖苷(批号：PS010712)、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷(批号：PS011865)、芦荟大黄素(批号：PS010375)、大黄酸(批号：PS010625)、大黄素(批号：PS000264)、大黄酚(批号：PS011322)、大黄素甲醚(批号：PS010626)，由成都普思生物科技有限公司提供，所有对照品质量分数均大于98%。

1.3 实验样品

20批掌叶大黄饮片购自药店，经甘肃中医药大学王明伟副教授鉴定为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.的干燥根或根茎。详细信息如表1。

表1 大黄饮片样品信息

2 结果与分析

2.1 供试品溶液制备

取1 g大黄粉末(过60目筛)，加30 mL 60%乙醇，置于具塞锥形瓶中，称定质量，超声提取30 min，放冷，称定质量，用60%乙醇补足减失质量，摇匀，滤纸滤过，取续滤液，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得[9]。

2.2 对照品溶液制备

精密称取对照品没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚各0.0251、0.0912、0.0422、0.0511、0.1521、0.0244、0.02312、0.0662、0.0374、0.0813、0.0355、0.1512、0.0072 g，以甲醇定容100 mL容量瓶以配制成0.25、0.91、0.42、0.51、1.5、0.24、0.23、0.66、0.37、0.81、0.35、1.52、0.72 mg/mL的混合对照品溶液，以鉴定样品成分。

2.3 HPLC指纹图谱的建立

2.3.1 色谱条件

色谱柱Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～15 min，2%→15% A；15～20 min，15%→20% A；20～30 min，20%→20% A；30～60 min，20%→30% A；60～80 min，30%→55% A；80～90 min，55%→75% A；90～95 min，75%→80% A；95～100 min，80%→100% A；进样量10 μL；检测波长为254 nm；柱温30 ℃；体积流量0.8 mL/min。

2.3.2 方法学考察

对精密度、稳定性、重复性进行考察，结果表明样品色谱图相似度RSD均小于3%，符合要求。

2.3.3 指纹图谱测定

各样品按“2.1”项制备供试品溶液，按“2.3.1”项色谱条件进样，建立大黄样品HPLC指纹图谱。图1为对照图谱，以鉴定大黄样品中的成分。20批样品色谱采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件对指纹图谱进行处理(见图2)。结果表明各产地大黄饮片相似度在0.702～0.962之间，S1～S20相似度依次为 0.821、0.766、0.766、0.897、0.899、0.962、0.754、0.702、0.955、0.928、0.935、0.779、0.84、0.897、0.766、0.81、0.702、0.93、0.899、0.897。共确定14个共有峰，其中共有峰与对照指纹图谱之间的相关系数均大于0.90，表明共有峰能够标示样品成分特征。共有峰1～14的相对保留时间为3.31、4.08、8.07、8.87、9.41、18.71、25.91、67.11、74.88、77.56、79.21、86.44、92.72及95.53 min(见图3)，峰面积如表2。通过对图1与图3的色谱图对比发现共有峰1、2、3、4成分未知，共有峰5为没食子酸、共有峰6为儿茶素，共有峰7为芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷，共有峰8未知，共有峰9为芦荟大黄素，共有峰10为大黄酸，共有峰11未知，共有峰12为大黄素，共有峰13为大黄酚，共有峰14为大黄素甲醚。

表2 各共有峰峰面积

图1 混合对照品(A)及大黄样品(B)的HPLC色谱图

图2 样品指纹图谱

图3 各共有峰图谱

2.4 总多酚含量测定

配制没食子酸浓度为0.51 mg/mL的对照品溶液。取“2.1”项供试品溶液0.02 mL、1 mL福林酚溶液、2.0 mL 15% Na2CO3溶液以蒸馏水定容10 mL容量瓶，40 ℃避光反应40 min于760 nm 处测定吸光度A值。分取上述对照品溶液0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175 mL，按上述方法测定A值[10]，以标准品的浓度(μg/mL)为横坐标，以吸光度值(A)为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，得标准曲线方程。总多酚含量以没食子酸计。没食子酸标准曲线为y= 0.135 7x-0.093 1(R2=0.999 6，n=6)，线性范围为0.002 5～0.008 9 mg/mL，线性关系良好，各样品总多酚含量在4.92±0.21～10.12 ± 0.11 mg/g，如下图4所示。

图4 各样品总多酚含量

2.5 总蒽醌含量测定

取样品粉末1 g(过60目筛)，按照药典方法制备[11]，甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)，波长254 nm，进样量10 μL。配制0.15、0.12、0.18、0.48、0.65 mg/mL的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的储备溶液，按梯度稀释，以峰面积为纵坐标(y)，对照品质量浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，并进行线性回归，得标准曲线方程。色谱峰如下图5所示。5种蒽醌类成分的标准曲线如表3所示。总蒽醌含量如图6所示，各样品总蒽醌含量在1.06 ± 0.08～4.82 ± 0.12 mg/g之间，其中批号为170621的渭源县产地大黄饮片总蒽醌含量不符合药典要求。

表3 标准曲线回归方程

图5 混合对照品(A)及大黄样品(B)的HPLC色谱图

图6 各样品总蒽醌含量

2.6 体外抗氧化试验

2.6.1 DPPH 自由基清除能力测定

预先配置0.47 mg/L的DPPH溶液。取“2.1”项各供试品溶液0.01 mL稀释至2 mL作样品液。将试管标记为A0、A1、A2。A0：2mL无水乙醇 + 2 mL DPPH溶液；A1：2 mL样品 + 2 mL DPPH溶液；A2：2 mL样品 + 2 mL无水乙醇；摇匀后避光反应30 min，在517 nm处测吸光度A值[12]。DPPH自由基清除率按照如下公式计算。

2.6.2 ABTS清除能力测定

在避光、室温条件下将20 mg ABTS与5 mL 2.4 mol/L的过硫酸钾溶液混合反应12 h得ABTS储备液。以无水乙醇稀释1.1 mL ABTS储备液至100 mL作为工作液。依次加入4 mL ABTS工作液与0.02 mL供试液，室温、避光放置30 min，于734 nm波长处测定，记为A1。A0：4 mL ABTS工作液 + 0.02 mL无水乙醇；A2：4 mL 无水乙醇 + 0.02 mL供试液[13]。ABTS自由基清除率如上“2.6.1”项公式计算。

各样品对DPPH自由基清除能力与ABTS自由基清除能力各不同，其中对DPPH清除能力在(60.99± 0.09)%～(87.73 ± 0.22)%，对ABTS清除能力在(49.95 ± 0.11)%～(87.05 ± 0.21)%。各样品清除率如表4所示。

表4 自由基清除率

2.7 建立大黄体外抗氧化谱效关系

采用DPS软件、SIMCA 14.1软件及IBM SPSS Statistics 26软件进行数据统计分析。

2.7.1 聚类分析

以共有峰峰面积为变量，以平方欧氏距离(Euclidean距离)为区间，采用组内均连法对20批样品指纹图谱进行聚类热图(见图7)。聚类分析结果可知，20批样品可分为4类，S17、S7、S19、S5、S16等为一类，S15、S8、S12为一类，S13、S14、S4等为一类，其他为一类。即陇西县、临洮县为一类；宕昌县，礼县为一类；岷县，漳县为一类，渭源县为一类，结果表明各地区的掌叶大黄饮片质量各异。

图7 聚类热图

2.7.2 主成分分析(principal component analysis，PCA)

为进一步评价20批掌叶大黄饮片，以14种共有峰为变量进行PCA分析，结果见图8。由PCA可知，结果与聚类分析基本一致。根据特征值和贡献率选出主成分，结果见表5。以特征值>1，提取出主成分有5个，其累积贡献率为 86.72%。完全符合累计贡献率大于80%和以最少的主成分数量来提供最多的原始数据所代表的信息的原则，故确定5个主成分。

表5 特征值与方差贡献率

图8 主成分分析图

2.7.3 偏最小二乘回归法(PLS)

基于主成分分析结果，建立了共有峰与DPPH清除率、ABTS清除率的偏最小二乘回归分析。回归系数绝对值反映共有峰对自由基清除率的贡献程度。变量重要性值(VIP)可评价自变量对因变量解释的重要程度[15]，当VIP >1表明自变量是重要因素。结果表明共有峰7(芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷)、1、10(大黄酸)、3、8、12(大黄素)具有清除DPPH自由基的作用。共有峰7、1、10、3、8、12及14(大黄素甲醚)具有清除ABTS自由基的作用(见图9)。表明这些成分协同起到抗氧化作用。

图9 各共有峰清除DPPH(A)和ABTS(B)自由基活性的变量重要性分析

2.7.4 灰色关联度分析(grey relational analysis，GRA)

本实验对原始数据采用初值化变换法，将清除率指标作为母序列，以共有峰峰面积作为子序列[15]，结果见表6。关联度越大则说明化学成分与抗氧化作用越强。由表6可知，共有峰与清除DPPH自由基活性的关联度大于0.38，与清除ABTS自由基活性的关联度大于0.34。共有峰2、9(芦荟大黄素)、13(大黄酚)对清除DPPH自由基的贡献最大，共有峰2、9、14(大黄素甲醚)对清除ABTS自由基贡献最大，故可初步将这些化合物作为大黄抗氧化指纹图谱药效控制点。

表6 共有峰与抗氧化作用的灰色关联度结果

2.7.5 总多酚、总蒽醌及自由基清除率的相关性分析

采用SPSS Statistics 26进行Pearson相关性分析。结果表明共有峰10(大黄酸)与清除DPPH自由基活性呈正相关。共有峰7(芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷)清除DPPH自由基活性呈负相关。以上结果说明，共有峰10(大黄酸)有利于清除DPPH自由基活性，而共有峰7(芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷)不利于清除DPPH自由基活性，这可能是因为DPPH法测定的机理是DPPH使待测有机物形成不稳定的自由基中间体，进而双分子偶联，形成稳定的最终产物，大黄酸属单蒽核类1，8-二羟基蒽醌衍生物，1，8位羟基和9位羰基,形成完整的大π键共轭体系，在乙醇溶液中，大黄酸配合物可能不稳定，易形成自由基中间体，从而表现抑制率较高，进而呈现正相关。而芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷在乙醇溶液中，较为稳定，不易形成自由基中间体，从而表现抑制率较低，呈现负相关。共有峰13(大黄酚)与清除ABTS自由基活性呈弱正相关，这与文献报道符合，大黄蒽醌类化合物具有较低的清除ABTS自由基活性能力，共有峰2、11与清除ABTS自由基活性负相关，这两个化合物极有可能是不含或较少含有提供活性氢的羟基基团，清除ABTS自由基活性取决于化合物分子的结构，酚羟基的数量和位置是影响其抗氧化活性的主要因素，能够提供的活性氢越多，其抗氧化能力越强。这与没食子酸、儿茶素或表儿茶素、双花母草素等具有较强的清除ABTS自由基活性，而蒽醌类成分的清除作用较弱的研究结果一致[6]。总多酚与清除ABTS自由基活性显著正相关，与清除DPPH自由基活性无显著相关性。总蒽醌与清除DPPH自由基活性负相关，与清除ABTS自由基活性无相关性。

2.8 体外抗氧化色谱峰对比

为了更清楚阐明大黄发挥抗氧化作用的成分，将大黄提取液分别与DPPH溶液及ABTS溶液反应，通过反应前后色谱峰面积说明发挥抗氧化作用的具体成分。操作步骤如下：取“2.1”项各供试品溶液0.05 mL作样品液。将试管标记为A0、A1、A2。A0：0.2 mL 60%乙醇 + 0.05 mL样品液；A1：0.2 mL 2 mg/mL DPPH溶液 + 0.05 mL样品液；A2：0.2 mL ABTS储备液 + 0.05 mL样品液；摇匀后避光反应30 min，按“2.3.1”色谱条件进样测定，即得大黄体外抗氧化反应前后色谱图(见图10)。

图10 A0、A1和A2的HPLC色谱图

结果表明，大黄抗氧化作用是不同成分共同作用的结果，如表7在4.14 min共有峰2，9.45 min共有峰5(没食子酸)峰面积明显减少。清除ABTS自由基活性后，在23.84 min峰面积增加、而95.53 min共有峰14(大黄素甲醚)的峰面积显著减少。清除DPPH自由基活性后，在92.93 min共有峰13(大黄酚)峰面积则显著增加。

表7 反应前后峰面积

3 讨论与结论

20批大黄饮片总蒽醌含量在1.06 ± 0.08～4.82 ± 0.12 mg/g，总多酚含量在4.92 ± 0.21～10.12 ± 0.11 mg/g。可将20批大黄饮片可分为4类，即陇西县、临洮县为一类，宕昌县、礼县为一类，岷县、漳县为一类，渭源县为一类。共有峰7(芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷)、1、10(大黄酸)、2、9(芦荟大黄素)具有清除DPPH自由基活性的作用，共有峰7、2、9、10、3、8、12(大黄素)、14(大黄素甲醚)具有清除ABTS自由基活性的作用，这与体外抗氧化色谱峰面积变化结果基本一致，表明大黄发挥抗氧化作用是多成分共同作用的结果。共有峰10(大黄酸)清除ABTS自由基呈现正相关，共有峰7(芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷)负相关。这可能是共有峰10(大黄酸)能形成完整的大π键共轭体系，在乙醇溶液中，大黄酸配合物可能不稳定，易形成自由基中间体，从而表现抑制率较高，呈现正相关。共有峰7(芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷)在乙醇溶液中较为稳定，不易形成自由基中间体，从而表现抑制率较低，呈现负相关。共有峰2、11清除ABTS自由基活性呈现负相关，这两个化合物极有可能是不含或较少含有提供活性氢的羟基基团，清除ABTS自由基活性取决于化合物分子的结构，酚羟基的数量和位置是影响其抗氧化活性的主要因素，能够提供的活性氢越多，其抗氧化能力越强。因此，本课题后续完善上述未知共有峰的指认和鉴定，从而进一步明确大黄体外抗氧化作用的药效基础。

本实验考虑到多酚类成分因自身的不稳定性，避免高温条件对成分的损失而选择超声提取。对比色谱峰峰面积变化明显的成分，后续通过制备液相分离出单体成进行抗氧化验证，采用LC-MS技术及核磁技术鉴定分离产物，明确发挥作用的单一成分也是今后研究的方向。中药指纹图谱质和量的特征和药材生物学活性研究结果相联系建立关联数学表达式可用于评价中药材质量[9]。本文在建立大黄指纹图谱，确定大黄饮片总蒽醌及总多酚含量的质和量的基础上进一步建立大黄体外抗氧化作用的谱效关系，明确了大黄清除DPPH自由基活性及ABTS自由基活性的有效群，明确了大黄发挥抗氧化作用的成分，如没食子酸，大黄素，大黄素甲醚等，这为大黄抗氧化活性药效物质成分的筛选及区分不同产地大黄提供理论依据。