基于UPLC-QTOF-MS分析不同产地铁皮石斛化学成分含量差异

陈定康，李芝兰，杨 柳，胡江苗

1中国科学院昆明植物研究所；2中国科学院昆明植物研究所植物医生研发中心，昆明 650201；3中国科学院大学，北京 100049

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生型草本植物，自古以来都是我国应用中药材中的名品，其自然主要分布区在安徽、浙江、湖南、福建、广西、四川、云南等地[1]。铁皮石斛的人工种植主产区为云南、浙江、安徽、广东。铁皮石斛中含有多种化学物质，包括多糖、生物碱类、黄酮类、联苄类、木脂素类及挥发性化学成分等活性成分，具有极高的药用价值[2]。传统中医认为铁皮石斛具有益胃生津，滋阴清热的功效，用于治疗热病津伤、口干烦渴、胃阴不足、食少干呕等症状[3]。现代药理学研究表明，铁皮石斛中的黄酮类成分具有降血糖功效[4]，联苄类和多糖类成分可以抗炎[5]，联苄、黄酮及酚性成分具有抗氧化活性[6]，联苄类成分具有抗癌作用[7]，多糖可以调节机体免疫力[8]等。

铁皮石斛作为药用植物，其产量和品质受原植物种类、生长面积、种植技术、土壤养分、气候条件、采收期等因素的影响[9]。铁皮石斛野生产量稀少，目前市场上流通的商品铁皮石斛主要来源于全国各地的人工种植基地[10]。由于种植基地分布范围较为广泛，各地出产的铁皮石斛生长过程中的各种条件无法保证一致，势必造成铁皮石斛药用价值的差异。根据2020版《中国药典》对铁皮石斛品质的评价方法，以多糖及醇溶性浸出物的含量为评价品质好坏的标准[11]。药典中规定的多糖及醇溶性浸出物都为粗提物，且检测方法比较简略，容易产生较大误差。这说明只以多糖及醇溶性浸出物含量作为铁皮石斛品质的评价指标是具有一定局限性的，所以选择一种铁皮石斛中含量较高并具有良好的药理活性的化学成分进行质量标定是势在必行的[12]。本实验拟对不同产地铁皮石斛中除多糖外的其他化学成分进行全面分析，找出评价铁皮石斛质量的标志组分，完善铁皮石斛的质量评价标准。

1 材料

1.1 材料与试剂

本研究所用植物材料是铁皮石斛的茎部位，采集于云南、安徽、浙江和广东等23个不同产地，产地具体信息见表1，为了方便讨论，每个产地都有一个特定的编号TPX(X=1～23)。所有植物材料都经过吴之坤博士(贵阳中医药大学，贵州贵阳)鉴定。石斛酚(纯度≥99.15%)和柚皮素(纯度≥99.64%)两种标准品由本实验室自行提取。

表1 不同产地铁皮石斛样本来源的地理信息

1.2 仪器与设备

Waters Xevo TQ-S超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(美国 Waters公司)；Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(美国Agilent Technologies公司)；BT125D型分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 醇提物的制备

2.1.1 提取工艺

铁皮石斛的茎放置在烘干机中，烘干温度设置为80 ℃，完全干燥后打成粉末。称取一定量的粉末，按1∶10(粉末∶80%乙醇，m/V)比例加入溶剂，80 ℃水浴加热回流提取2次，每次2 h。收集提取液，去除溶剂后即得不同产地的铁皮石斛醇提物。

2.1.2 醇提物得率

醇提物收集后称重，用以下公式计算得率：

式中，m醇提物表示醇提物质量，m铁皮石斛粉末表示称得铁皮石斛粉末质量。

本次实验中，不同产地铁皮石斛醇提物得率结果如表2所示。醇提物得率范围为6.80%～17.84%。

表2 不同产地铁皮石斛醇提物得率和定量分析结果

2.2 定性分析

由于受品种品系、种植环境、栽培管理以及采收时间等条件影响，铁皮石斛内含物构成以及含量差异明显。故此，我们利用UPLC-QTOF-MS对不用产地的铁皮石斛醇提物进行了化学成分分析。

2.2.1 分析条件

使用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF)分析醇提物的化学组成。液相色谱流动相100%水溶液(A)-100%乙腈溶液(B)，梯度洗脱，洗脱顺序为：0～30 min，20%→100% B；30～31 min，100%→20% B；31～35 min，20% B。检测波长：280 nm，流速：1 mL/min，柱温：30 ℃，色谱柱型号为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)。质量检测器设定为ESI负离子模式。干燥气温度：350 ℃；干燥气流量8 L/min；雾化器压力：30 psig；毛细管电压：3 500 V；碰撞电压：-175 V；锥孔体：-65 V；相对分子质量扫描范围：m/z50～1 700。

2.2.2 铁皮石斛中化合物的鉴定

根据第“2.2.1”节的方法，分析了23个铁皮石斛醇提物样本。为确定最佳检测波长，本试验同时考察了230、254、280 nm的色谱峰分离情况，结果显示230 nm的谱图中化合物分离度较好、吸收较强，故选择230 nm作最终检测波长。23个铁皮石斛醇提物样品色谱图如图1所示。

图1 23个铁皮石斛醇提物样品的指纹图谱

将质谱数据导入Agilent Mass Hunter Workstation软件，对出峰初步处理。依据峰面积、保留时间和分子量，排除假阳性的碎片峰。采用Qualitative Analysis B.06.00软件拟合计算得到相应的分子式，结合质谱数据，与本地数据库进行匹配，初步推测化学成分，如图2所示。

图2 阿魏酰酪胺(A)和柚皮素(B)的质谱

对各产地铁皮石斛主要成分进行了表征，结果如表3所示。从不同产地铁皮石斛醇提物中共鉴定了(-)-lirioresinol B(1)、fructose-phenylalanine(2)、香草酸(3)、对羟基苯甲酸(4)、石斛碱(5)、对香豆酸(6)、3-羟基肉桂酸(7)、vicenin 2(8)、vicenin 1(9)、apiin(10)、4′-O-glucosylvitexin(11)、acanthoside B(12)、芦丁(13)、6-C-α-L-arabinopyranosyl-8-C-β-D-xylopyranosylapigenin(14)、vicenin 3(15)、moupinamide(16)、2′-O-Rhamnosylvitexin(17)、柚皮素(18)、dendronobiloside A(19)、石斛酚(20)、Pinellic acid(21)、N-isopentenyldendrobine(22)、dihydroconiferyl dihydro-p-coumarate(23)、densiflorol A(24)、2-methyl-1H-indol-7-ylβ-D-mannopyranoside(25)、2-hydroxydendrobine(26)、vanilloside(27)、aduncin(28)、acuminoside(29)、棕榈酸(30)、N-反式-对香豆酰酪胺(31)、eicosyl caffeate(32)等32种可能存在的化合物。对这32种成分进行进一步分析显示，(-)-lirioresinol B(1)、fructose-phenylalanine(2)、石斛碱(5)、对香豆酸(6)、vicenin1(9)、芦丁(13)、moupinamide(16)、柚皮素(18)、石斛酚(20)、densiflorol A(24)、vanilloside(27)、aduncin(28)、棕榈酸(30)等13种化合物是不同产地铁皮石斛的共有成分。

表3 不同产地铁皮石斛化学成分鉴定结果

2.3 标准品定量分析

准确称取标准品，用甲醇溶解成不同浓度用于制作标准曲线。使用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(Waters Xevo TQ-S)用来分析不同产地醇提物中石斛酚和柚皮素这两种物质的含量。液相色谱流动相为100%水(A)-100% 乙腈(B)，梯度洗脱，洗脱顺序为：0～4 min，20%→35% B；4～7 min，35%→100% B；7～8 min，100%→20% B；8～10 min，20% B。检测波长：280 nm，流速:0.3 mL/min，色谱柱型号为ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm)。在质量分析仪中选择多反应监测(MRM)进行定量分析。石斛酚的离子裂解跃迁为m/z302.85→287.85；柚皮素的离子裂解跃迁为m/z270.81→150.81。石斛酚和柚皮素的锥电压和碰撞能量分别为30 V和20 eV。优化的通用质谱条件为：脱溶剂温度350 ℃，脱溶剂气体600 L/h；毛细管电压2.5 kV，锥状气体流速150 L/h，碰撞气体流速0.10 mL/min。

2.4 方法学考察

2.4.1 定量标准曲线的绘制

按照目标化合物离子的响应情况，配制不同浓度混标溶液，以标准溶液浓度(x，μg/mL)与对应的峰面积(y)建立标准曲线如图3所示。由图得石斛酚的线性回归方程y=337.766x，在0～180 μg/mL浓度范围内，各目标化合物线性关系良好，相关系数(r)为0.999 7。柚皮素的线性回归方程y=213 346x，在0～5 μg/mL浓度范围内，各目标化合物线性关系良好，相关系数(r)为0.999 5。石斛酚的检出限和定量限分别为0.18 μg/mL(信噪比=3)和0.70 μg/mL(信噪比=10)；柚皮素的检出限和定量限分别为0.30 μg/mL(信噪比=3)和1.03 μg/mL(信噪比=10)。

图3 石斛酚(A)和柚皮素(B)的定量标准曲线

2.4.2 重复性实验

准确称取15号产地的样品10 mg，平行称量6份，进行定量分析，根据标准曲线方程得出待测物质的含量并计算出相对标准偏差(RSD)。测得待测分析物含量的RSD均小于5%，说明方法的重现性好。

2.4.3 加标回收实验

根据样品中石斛酚和柚皮素的含量及线性范围，确定化合物在样品中合适的加标量，设置低、中、高三个水平的加标量。加标回收实验的平均回收率和相对标准偏差数据见表4。实验结果说明方法的准确度能满足检测要求。

表4 加标回收实验

2.5 石斛酚和柚皮素的含量分析

石斛酚是一种铁皮石斛中常见的酚类化合物。有研究表明石斛酚可以诱导糖原合成酶激酶3β介导的MYC蛋白降解来达到抑制肺癌细胞增殖的目的[13]。还有资料显示，石斛酚在抗炎和抗氧化应激等方面具有潜在应用[14]。柚皮素则是石斛中一种常见的黄酮类活性成分，具有抗炎、抗氧化、改善血液质量，保护心血管系统等药理活性，具有广阔的开发前景[15]。通过多样本分析，联苄和黄酮是铁皮石斛化学物质构成主成分，这两类成分具有代表性和普遍性。因此，选取石斛酚和柚皮素作为衡量铁皮石斛品质的潜在标志化合物，两个化合物结构如图4所示。

图4 石斛酚(20)及柚皮素(18)结构

按所建立的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对23种不同产地铁皮石斛醇提物中的石斛酚和柚皮素含量进行检测分析，不同产地铁皮石斛醇提物样品中所含这两种化合物含量的结果如表2所示。如结果所示，不同产地铁皮石斛醇提物中都含有石斛酚和柚皮素这两个成分，只是在含量上存在差异。通过实验结果可以得出，通过对这两个化合物的含量测定来评价铁皮石斛质量是完全可行的。

3 讨论与结论

药用植物的活性表现受其次生代谢产物构成和含量的影响：一方面取决于药用植物本身由于品种因素造成的基因表达差异；另一方面，生长过程中降雨、温度、湿度、日照等农业气候条件和田间管理等对其品质也有着重要影响。随着对药用植物研究的不断深入，以单一化学成分为指标对中药材进行质量评价的体系出现了一定的局限性[16]。除了铁皮石斛多糖之外，铁皮石斛中还存在有相当可观的小分子化学成分[17]。广泛分析这些化学成分，将其与铁皮石斛的药材质量关联起来，进而找出生长环境和种植工艺与铁皮石斛品质之间的联系，对铁皮石斛质量评价标准的后期改进具有重要意义。

本研究利用UPLC-Q-TOF-MS对不同产地的铁皮石斛醇提物进行天然小分子构成和含量进行了探索，进一步探讨铁皮石斛这一常用中药的质量评价标准。对铁皮石斛醇提物进行定性分析，共鉴定了32种主要成分，利用化学分析软件和本地数据库对可能的结构和分子式进行推测，得到(-)-lirioresinol B、fructose-phenylalanine、香草酸、对羟基苯甲酸、石斛碱等化学结构。其中，有13种成分在不同产地铁皮石斛醇提物中均有检测得到，这表明铁皮石斛虽然受不同产地的影响所产生次生代谢物虽有一定差异但其主要活性成分认识具有很高的共性。铁皮石斛中富含酚性物质，主要为石斛酚代表的联苄类化合物和柚皮素代表的黄酮类成分。相应地，标准品定量分析结果显示，不同产地的铁皮石斛中石斛酚和柚皮素的含量存在差异，说明这两种化合物可以作为潜在的铁皮石斛质量评价指标。

近年来，本研究组一直关注铁皮石斛新成分、新功能的开发工作，尤其是铁皮石斛在化妆品领域的应用。Chen[18]和Qi[19]等对铁皮石斛多糖的保湿性能进行了研究，结果表明铁皮石斛多糖提取物具有良好的保湿作用，能提高皮肤细胞对干燥环境的耐受程度。除多糖外，铁皮石斛中还含有大量酚类化合物，这类天然的抗氧化剂在体外实验中表现出一定的DPPH、ABTS自由基清除活性[20,21]。目前，铁皮石斛作为一种高端化妆品原料已广泛用于美妆护肤产品中，受到广大消费者的青睐[22]。

为了阐明铁皮石斛醇提物中可能的活性成分，更好地用于护肤产品开发，我们对不同产地铁皮石斛醇提物进行了化学物质构成的分析工作，为铁皮石斛的科学合理利用提供理论基础。