发酵葛根与水提葛根的抗氧化活性与延缓线虫衰老的作用研究

赵 丹，吴 迪，李 萌，王昌涛，张佳婵，王冬冬

北京工商大学化学与材料工程学院 北京市植物资源研究与开发重点实验室，北京 100048

葛根(Puerarialobata)为豆科葛属植物的根，在我国分布广泛。作为传统的中药材，葛根具有治疗金疮、解热生津的作用，在《神农本草经》《本草拾遗》《中国药典》中均有记载[1,2]。随着中药理论的不断完善，以及人们追求健康的意识不断提高，许多药食同源的植物被开发并制成饮料、保健食品。当前研究具有抗衰老功效的植物很多，包括人参、葛根、沙棘、枸杞等[3]。其中葛根的抗衰老活性成分主要包含葛根异黄酮、葛根素、葛根多糖和生物碱。Zhou等[4]发现葛根素能够显著改善淀粉样前体蛋白/早老蛋白-1小鼠的认知障碍，降低脑组织中的氧化应激水平，葛根异黄酮能够增加大鼠血液和肝脏中抗氧化酶的活性，降低丙二醛的含量。Shao等[5]发现葛根多糖具有延长线虫寿命的功效。Li等[6]研究表明复方葛根片具有保护血管，抵抗氧化应激损伤，减缓血管老化的作用。

为使葛根功效成分更好地被吸收利用，当前葛根提取的方法多种多样，如水浴提取[7]、超声提取[8]、酶法提取[9]等。利用发酵技术对中草药进行提取，通过微生物代谢产生的次级代谢产物与中药成分共同作用可达到协同增效的效果，同时由于微生物胞外酶的作用，有助于中草药活性成分的释放[10]。

线虫是研究衰老的典型模式生物，具有易于培养、生长周期短、进化高度保守等特点，同时与人类基因的同源性较高，因此常用线虫进行抗衰老天然产物的筛选[11,12]。本文利用发酵法和水提法对葛根活性物质进行提取，并从抗氧化能力，对线虫寿命、产卵、热应激的影响，探究葛根发酵液与葛根水提液的抗氧化与抗衰老功效。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

黄酒酵母，由实验室保存；大肠杆菌EscherichiacoliOP50、野生型秀丽隐杆线虫由北京市农林科学院提供。葛根，购于北京同仁堂药店。

七水硫酸镁(批号：20170522)、无水氯化钙(批号：20200817)、磷酸二氢钾(批号：20190324)、胆固醇(批号：20180916)、氯化钠(批号：20200415)、次氯酸钠(20191008)、氢氧化钠(批号：20180215)、葡萄糖(批号：20190713)、亚硝酸钠(批号：20190602)、硝酸铝(批号：20190421)、硫酸亚铁(批号：20160613)、水杨酸(批号：20180527)、双氧水(批号：20191120)购自国药集团化学试剂有限公司；苯酚(批号：20180821)、甲醇(批号：20180506)、浓硫酸(批号：20190615)购自北京化工厂；蛋白胨(批号：20201102)、酵母浸粉(批号：20200713)购自北京拜尔迪生物技术有限公司；维生素C(批号：L2017033)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Trizol试剂(批号：S0147)，总抗氧化能力检测试剂盒(批号：S0119)、BCA蛋白浓度检测试剂盒(批号：S0131S)购自碧云天生物科技有限公司；cDNA合成试剂盒(批号：011228)购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 仪器和设备

BXM-30R高压蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司)；TGL-20br高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；Multiskan FC酶标仪(美国赛默飞世尔仪器公司)；Real-time PCR仪(美国应用生物系统公司)；DQHZ-2001A恒温震荡培养箱(太仓华美生化仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 葛根发酵液与水提液的制备

制备葛根水提液：取10 g葛根粉末加入200 mL去离子水，70 ℃水浴提取3 h，4 800 r/min离心30 min，取上清液，得到葛根水提液，使用0.22 μm滤膜过滤。

制备葛根发酵液：取10 g葛根粉末加入200 mL去离子水，121℃高压灭菌，冷却后，接种黄酒酵母，于28 ℃培养箱中震荡培养48 h。将发酵液于4 800 r/min离心30 min，得到上清液，使用0.22 μm滤膜备用。

1.2.2 活性成分检测

黄酮含量检测采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，多酚检测采用福林酚还原比色法[13]，葛根素含量检测采用高效液相色谱法[14]。

1.2.3 抗氧化活性测试

1.2.3.1 总抗氧化能力检测

取96微孔板，每孔加入20 μL过氧化氢酶工作液；标准曲线孔加入10 μL不同浓度的Trolox标准溶液，样品检测孔内加入10 μL不同浓度的样品；接着每孔加入170 μL ABTS工作液，混合均匀；室温孵育6 min后于414 nm测定吸光度，根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。

1.2.3.2 羟自由基清除能力检测

取0.5 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加入1 mL 0.15 mol/L PBS和0.5 mL蒸馏水，接着加入0.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液，混匀后加入0.01%双氧水0.5 mL。37 ℃水浴1 h后，于536 nm测量吸光值测得数值为A1。

式中，A2为将蒸馏水代替双氧水测得吸光度值；A样品为样品代替蒸馏水测得的吸光度。

1.2.3.3 超氧阴离子清除能力检测

取0.05 mol/L 的Tris-HCl(pH 8.2)缓冲液2.25 mL于试管中，置于25 ℃水浴中预热20 min；分别加入不同浓度的样品0.05 mL和0.2 mL的25 mmol/L邻苯三酚溶液，混合均匀后于25℃水浴中反应5 min；加入0.5 mL 8 mol/L盐酸终止反应，测量299 nm处吸光值，计算清除率。空白对照组以0.05 mL试样溶剂代替样品。

式中，A1为空白的吸光度，A2为样品的吸光度。

1.2.4 葛根发酵液和水提液对线虫生长及基因表达的影响

1.2.4.1 线虫的培养及同期化

配制NGM培养基涂平板，待凝固后，向NGM平板加入200 μLE.coliOP50菌液并涂布均匀，将平板皿置于37 ℃过夜培养。将L4期线虫转移至NGM平板，20 ℃培养。

同期化线虫的培养：选取生长状态良好的线虫，用4.5 mL无菌水将其收集至离心管中。加入2 mL裂解液，每隔2 min涡旋振荡一次，重复4～6次，至线虫裂解完全。将裂解后的混合溶液转移至1.5 mL离心管，3 000 r/min离心1 min，弃上清。再加入无菌水冲洗线虫，离心后弃上清，重复3次。吸取离心管底部虫卵，滴在涂有E.coliOP50的NGM平板无菌区，直至吹干，20 ℃培养48 h后受精卵发育成L4期线虫，为后续实验备用。

1.2.4.2 葛根水提液、葛根发酵液对线虫寿命的影响

配制含有不同浓度样品的平板，使葛根水提液、葛根发酵液在E.coliOP50菌液中的终浓度为1、5 μg/mL，对照组为M9缓冲液。将同期化后的线虫挑至含有样品的培养基中于20 ℃培养，每板30条线虫，每组做三个平行。每天将线虫挑至新的相应培养皿中并记录线虫的存活和死亡数量，直到所有线虫死亡。若线虫刺激两次无反应，判断其死亡。线虫发生逃逸、干死、生殖道外翻，则被剔除。根据实验记录数据制作线虫寿命曲线。

1.2.4.3 葛根水提液、葛根发酵液对线虫生殖能力的影响

配制含有葛根水提液、葛根发酵液的培养基，使得在E.coliOP50菌液中终浓度为5 μg/mL(寿命实验筛选出的最佳浓度)，对照组为M9缓冲液。将同期化后的线虫挑至平板中，每个平板1条线虫，共10个平行，置于20 ℃培养。每天将线虫挑至新的平板中，直至产卵期结束，统计每条线虫的产卵量。

1.2.4.4 葛根水提液、葛根发酵液对线虫抗热应激的影响

配制含有葛根水提液、葛根发酵液的培养基，使得在E.coliOP50菌液中终浓度为5 μg/mL(寿命实验筛选出的最佳浓度)，对照组为M9缓冲液。将同期化线虫挑至平板中，每板挑30条线虫，共10个平行。置于35 ℃培养，开始计时为0 h。每隔2 h将线虫快速取出，记录存活和死亡数量。由于平板从培养箱取出，温度发生变化会对实验结果造成影响，取出后即丢弃平板。

1.2.4.5 线虫衰老相关基因检测

配制含有葛根水提液、葛根发酵液的培养基，使得在E.coliOP50菌液中终浓度为5 μg/mL(寿命实验筛选出的最佳浓度)，对照组为M9缓冲液。将同期化线虫挑至平板中。每个平板30条线虫，共3个平行组。每天将线虫挑至新的平板中，培养5天后，将成虫冲洗收集至离心管中，3 500 r/min离心1 min，弃去上清液后用M9缓冲液将秀丽隐杆线虫重悬，于3 500 r/min离心1 min，重复三次。液氮速冻之后，保存于-80 ℃冰箱备用。使用Trizol法提取线虫RNA。使用cDNA第一链合成试剂盒将RNA逆转录成cDNA后进行荧光定量检测。基因引物序列见表1。

表1 基因引物序列表

1.2.5 数据分析

实验中数据均做三个重复，数据分析使用SPSS statistics 软件。两两比较采用t检验，多重比较使用单因素ANOVA，显著性标准：*P<0.05，**P<0.01。

2 结果与分析

2.1 葛根发酵液与水提液成分分析

葛根富含异黄酮类成分，包含葛根素、大豆苷元和大豆苷等[15]。如表2所示经过发酵，葛根发酵液(fermented broth ofP.lobata，FBP)与葛根水提液(aqueous extract ofP.lobata，AEP)活性成分有明显区别，其中总黄酮含量有较大增加，增加率约为38.3%，总酚含量降低，葛根素含量增加4.51%。这可能是由于发酵过程中微生物代谢产生的酶将植物细胞壁分解，有助于功效成分的释放[16]，从而使葛根发酵液中葛根素和黄酮含量增加。

表2 样品成分含量

2.2 葛根发酵液与水提液的抗氧化功效

2.2.1 葛根水提液、葛根发酵液的总抗氧化能力的检测

如图1a所示，当葛根发酵液体积浓度低于5%时，葛根水提液的总抗氧化能力较高，随着浓度的增加，相同体积浓度的葛根发酵液总抗氧化能力高于葛根水提液，当体积浓度为20%时葛根发酵液的总抗氧化能力最强，约与1.62 mmol/L Trolox标准品相当。因此葛根水提液、葛根发酵液均具有一定的抗氧化能力，且在高浓度时葛根发酵液的总抗氧化能力更强。本实验阳性对照为Vc，其总抗氧化能力标准曲线如图1b，200 μg/mL Vc的总抗氧化能力为0.86 mmol/L，与6.67%的葛根发酵液相近。

图1 不同样品的总抗氧化能力

2.2.2 葛根水提液、葛根发酵液对羟自由基清除能力的检测

如图2a所示，葛根水提液与葛根发酵液对羟自由基的清除能力呈剂量相关。当体积浓度低于5%以内时，两者清除羟自由基的能力接近，当体积浓度在6.67%～20%之间时，葛根发酵液清除羟自由基的能力大幅增加。葛根发酵液与葛根水提液清除超氧阴离子的IC50分别为5.66%、11.35%。因此两种发酵液均具有良好的清除羟自由基的能力，且葛根发酵液在高体积浓度时清除羟自由基的能力更强。阳性对照Vc对羟自由基的清除作用与浓度呈正相关，如图2b所示，Vc清除羟自由基的IC50为39.32 μg/mL。

图2 不同样品对羟自由基的清除作用

2.2.3 葛根水提液、葛根发酵液对超氧阴离子清除能力的检测

如图3a所示，当样品体积浓度在4%～20%时，葛根发酵液清除超氧阴离子能力始终高于葛根水提液，当体积浓度达到20%时，葛根发酵液、葛根水提液对超氧阴离子清除率分别为97.5%、82.5%。葛根发酵液和水提液清除超氧阴离子的IC50分别为4.21%和6.68%。阳性对照Vc清除超氧阴离子的效果如图3b所示，其对超氧阴离子的清除能力与作用浓度呈正相关，IC50为23.8 μg/mL。

图3 不同样品对超氧阴离子的清除作用

2.3 葛根发酵液与水提液延缓线虫衰老的功效

2.3.1 葛根水提液、葛根发酵液对线虫寿命的影响

葛根水提液、葛根发酵液对线虫寿命的影响如表3所示。1 μg/mL葛根发酵液作用组线虫的平均寿命为14.56±1.01天，最大寿命为26.39±1.44天，均高于对照组。5 μg/mL葛根发酵液作用线虫的平均寿命为17.38±1.08天，显著高于对照组(P<0.05)，最大寿命为30.82±1.61天，与对照组相比差异显著(P<0.05)。葛根水提液实验组中，与对照组相比，1 μg/mL和5 μg/mL实验组线虫的平均寿命和最大寿命均无显著性差异。由此可知，5 μg/mL葛根发酵液能够显著延缓线虫的衰老，增加线虫的寿命。

表3 葛根水提液、葛根发酵液对线虫寿命的影响

由线虫的生存曲线可以得知，实验的第1天至第8天，线虫均处于良好的生存状态，运动灵活。从第8天开始线虫开始出现死亡的现象，其运动缓慢，感应外部刺激能力降低，5 μg/mL葛根发酵液延长线虫寿命效果均优于1 μg/mL(见图4)。

图4 葛根发酵液和水提液对线虫存活率的影响

2.3.2 葛根水提液、葛根发酵液对线虫生殖能力的影响

线虫的产卵能力和线虫的生长发育状况有关，通常线虫长至成虫才能产卵[17]。葛根发酵液、葛根水提液对线虫生殖能力的影响如表4所示。实验选用延长线虫寿命较为显著的5 μg/mL为作用浓度，统计线虫第1天至第5天的产卵量。葛根水提液作用后，线虫的总产卵量为262.27±17.25个，与对照组相比，产卵量变少，减少率为9.54%，但变化并不显著。葛根发酵液作用后，线虫的总产卵量为303.85±20.16个，与对照组相比，增加率为4.8%，产卵量显著增加(P<0.05)。有衰老理论认为，寿命的延长以生殖减少或丧失为代价[18]，但是葛根发酵液在延长线虫寿命的同时并未对线虫的生殖造成损伤。

表4 葛根水提液、葛根发酵液对线虫生殖的影响

2.3.3 葛根水提液、葛根发酵液对线虫抗热应激的影响

由图5和表5可知，葛根水提液作用线虫后，线虫的平均耐热时间为24.03±1.08 h，与对照组相比增加率为5.72%，最长耐热时间为38.33±3.67 h，最长耐热时间增加率为11.1%。葛根发酵液作用线虫后，线虫的平均耐热时间为25.57±1.26 h，最长耐热时间为39.04±2.35 h，与对照组相比，平均耐热和最长耐热时间均显著延长(P<0.05)，分别增加12.49%和13.16%。

表5 葛根水提液、葛根发酵液对线虫耐热时间的影响

图5 热应激条件下葛根发酵液和水提液对线虫存活率的影响

2.3.4 葛根发酵液对线虫衰老相关基因的表达的影响

秀丽隐杆线虫体内的胰岛素信号传导途径Insulin/IGF对于线虫的衰老的调节起关键性作用[19]。此通路中的daf-2基因是线虫衰老的关键基因，发育过程中daf-2通过抑制daf-16表达从而影响线虫的寿命[20-22]。hsp-16.2和sod-3基因是位于daf-16的下游效应因子，在线虫受到外界热应激和氧化应激时，daf-16会在这些逆境信号的刺激下迅速向细胞核转移，进而诱导这些下游效应元件的高表达，以此抵抗外界胁迫造成的压力[23-25]。由图6可知葛根发酵液能够显著增加线虫体内daf-16(P<0.05)、hsp-16.2(P<0.01)、sod-3(P<0.01)的表达量，同时下调daf-2表达。由此说明，在热应激条件下，葛根发酵液作用下的线虫可能通过抑制daf-2的表达，促进daf-16进入细胞核转录，从而促使daf-16下游基因sod-3、hsp-16.2的表达，其中sod-3基因表达量上调显著，表明线虫在葛根发酵液的作用下超氧化物歧化酶过量表达，因此能够更加高效的清除线虫体内的活性氧和自由基，进而延长线虫寿命。

图6 葛根发酵液和对线虫基因表达的影响

3 讨论与结论

葛根作为药食两用的中草药，具有清除自由基、退热生津、预防心脑血管疾病等功效，其中葛根黄酮类和异黄酮类物质是其主要功效成分，具有良好的抗氧化性。本文通过发酵和水提两种方式对葛根的活性成分进行提取，比较发现经过发酵得到的提取液中黄酮含量为4.8±0.32 mg/mL，显著高于水提法得到的黄酮含量3.47±0.23 mg/mL(P<0.01)，发酵法提取获得的葛根素含量略高、总酚含量略低，但是均无显著性差异。为进一步对两种提取液的抗氧化和抗衰老效果进行评估，首先采用3种体外的自由基的清除模型对提取物的抗氧化能力进行检测，结果显示6.8%体积浓度的葛根发酵液在总抗氧化能力、对羟自由基和超氧阴离子的清除能力均强于葛根水提液，葛根发酵液抗氧化效果更佳。

线虫作为衰老的模式生物，广泛用于中药提取物延缓衰老的评价。将发酵液与葛根水提液分别作用于秀丽隐杆线虫，在正常培养条件下与对照组相比，葛根发酵液能够显著延长线虫的寿命(P<0.05)，在热应激条件下，葛根发酵液培养的线虫耐热时间显著高于对照组(P<0.05)。产卵实验表明葛根发酵液在延长线虫寿命的同时不以牺牲线虫的产卵为代价，其产卵量高于葛根水提液组。基因检测结果显示葛根发酵液通过下调促衰老基因daf-2，上调抗衰老基因daf-16、抗氧化基因sod-3以及热应激基因hsp-16.2的表达，实现对高温的耐受性以及更高的抗氧化能力，从而实现延长线虫寿命的作用，葛根发酵液延长线虫寿命作用机制见图7。

图7 葛根发酵液延长线虫寿命作用机制示意图

Zhang等[26]将葛根黄酮喂食线虫的存活率显著高于对照组。Shao[5]研究显示葛根水提多糖作用能够保护线虫抵御热应激损伤，同时增强运动能力，延长线虫寿命。Jeon[27]研究结果表明葛根素对结肠炎小鼠有抗炎和抗氧化功效。由此可知葛根发酵液延缓线虫衰老的功效是由发酵液中黄酮、多糖、葛根素等多种物质共同作用的结果。结合本课题组此前研究结果[28]，葛根水提液中总糖含量(3.46±0.18 mg/mL)高于葛根发酵液(2.52±0.5 mg/mL)，但是葛根水提液在延缓线虫衰老效果并不显著。推断葛根发酵液中的主要功效成分黄酮在延缓线虫衰老方面起关键作用。

本课题组[28]从生化水平和细胞水平对葛根水提液与葛根发酵液的抗氧化和抗衰老功效进行了检测，结果显示葛根发酵液在生化水平具有良好的清除DPPH自由基的效果，并能增加成纤维细胞中抗氧化酶活性，促进胶原蛋白的表达。为了更加全面地评价其抗氧化功效，本篇文章在生化水平补充了葛根两种提取液对羟自由基、超氧阴离子的清除效果以及总抗氧化能力水平的测试。由于细胞实验的局限性，为进一步对葛根发酵液的抗衰老效果进行验证，本篇文章使用衰老模式生物秀丽隐杆线虫作为研究对象，从动物水平检测了葛根发酵液延缓线虫寿命的效果和机制，因此更具备参考价值。结果表明葛根发酵液具有良好的抗氧化效果以及延缓线虫衰老的作用，其通过调节胰岛素信号通路Insulin/IGF中关键基因的表达发挥抗衰老功效。以上结果可为葛根发酵液在抗衰老食品、化妆品领域的开发应用提供一定的参考。